Effect of temperature up-shift on fermentation and metabolic characteristics in view of gene expressions in Escherichia coli
- 作者
- Chowdhurry Mohammad Monirul Hasan, Kazuyuki Shimizu
- 单位
- Department of Bioscience & Bioinformatics, Kyushu Institute of Technology; Institute of Advanced Bioscience, Keio University
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2008）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-7-35
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
揭示大肠杆菌从37°C升至42°C的热激响应如何影响代谢调控和发酵特性，特别是乙酸积累增加和细胞产量降低的分子机制，为温度诱导重组蛋白生产等应用提供理论依据。
研究策略
以大肠杆菌BW25113（野生型）及arcA基因敲除突变体为对象，进行好氧批式/连续培养和微好氧批式培养，比较37°C和42°C下的发酵参数；采用RT-PCR定量分析热激基因、全局调控因子和代谢途径基因的动态表达变化，结合统计检验阐明代谢调控网络。
核心内容
研究以大肠杆菌BW25113及其arcA突变株为对象，结合好氧连续培养、批式培养与微好氧批式培养，系统考察温度从37°C升至42°C时热激对发酵参数和代谢基因表达的时序影响。结果显示，好氧连续培养中升温使葡萄糖摄取率下降7.31%，乙酸生产速率增加77.8%，生物量产率降低19.0%；批式培养中42°C下乙酸最大浓度达2.91 g/L，细胞产量降至3.32 g/L。RT-PCR分析表明，热激基因rpoH、dnaK、groL等显著上调，同时全局调控因子mlc和arcA上调而ptsG下调，TCA循环基因icdA、sucA、aceA表达受抑，呼吸链cydB上调而cyoA下调。研究进一步揭示升温通过mlc抑制ptsG使糖摄取下降，而高温下溶解氧降低引发arcA上调，进而抑制TCA循环和cyoA，造成乙酸积累增加和细胞产量降低。arcA敲除可减少乙酸生成但伴随细胞产量下降。该工作为温度诱导重组蛋白生产中控制乙酸代谢、优化宿主菌株提供了分子层面的调控依据。
创新点
系统解析温度上调引发的热激基因、全局调控因子（如mlc、arcA、crp、cra）与代谢途径基因表达变化的时序关系；首次明确arcA基因上调是热激下TCA循环抑制和乙酸积累的关键因素，并提出通过arcA敲除来减少乙酸产生的策略；同时揭示了微好氧条件下温度对混合酸发酵产物分布的影响。
研究对象（19）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 | 热激响应 | rpoH | σ32 | 调控 | 热激σ因子，协调热激基因表达，温度上调后表达出现超调现象 |
| Escherichia coli BW25113 | 热激响应 | dnaK | DnaK/Hsp70 | 催化 | 分子伴侣，协助蛋白质折叠，表达模式与rpoH相似 |
| Escherichia coli BW25113 | 热激响应 | groL/groS | GroEL/GroES | 催化 | 伴侣蛋白，参与蛋白质复性，表达上调 |
| Escherichia coli BW25113 | 热激响应 | htpG | HtpG/Hsp90 | 催化 | 分子伴侣，表达上调 |
| Escherichia coli BW25113 | 热激响应 | ibpB | IbpB小热激蛋白 | 催化 | 保护热变性蛋白，表达上调 |
| Escherichia coli BW25113 | 葡萄糖转运 | ptsG | EIICBglc | 转运 | PTS葡萄糖特异性通透酶，受Mlc抑制，温度上调后表达下调导致葡萄糖摄取率降低 |
| Escherichia coli BW25113 | 全局调控 | mlc | Mlc | 调控 | 全局阻遏因子，受σ32调控，上调后抑制ptsG表达 |
| Escherichia coli BW25113 | 全局调控 | arcA | ArcA | 调控 | 双组分系统响应调控子，温度上调后表达增加，抑制TCA循环和cyoA，激活cydB |
| Escherichia coli BW25113 | TCA循环 | icdA | 异柠檬酸脱氢酶 | 催化 | TCA循环关键酶，受ArcA抑制，温度上调后表达下调 |
| Escherichia coli BW25113 | TCA循环/乙醛酸途径 | aceA | 异柠檬酸裂解酶 | 催化 | 乙醛酸途径关键酶，表达下调，导致乙酸同化减少 |
| Escherichia coli BW25113 | 呼吸链 | cyoA | 细胞色素bo3氧化酶亚基II | 能量供给 | 有氧呼吸末端氧化酶，受ArcA负调控，表达下调 |
| Escherichia coli BW25113 | 呼吸链 | cydB | 细胞色素bd氧化酶亚基II | 能量供给 | 低氧亲和呼吸氧化酶，受ArcA正调控，表达上调 |
| Escherichia coli BW25113 | 全局调控 | crp | cAMP受体蛋白 | 调控 | 上调激活lpdA等，影响碳代谢 |
| Escherichia coli BW25113 | 全局调控 | cra | Cra（catabolite repressor/activator） | 调控 | 下调导致糖异生激活、糖酵解抑制，并影响TCA循环基因表达 |
| Escherichia coli BW25113 | 乙酸代谢 | acs | 乙酰辅酶A合成酶 | 催化 | 乙酸同化途径关键酶，表达下调，减少乙酸再利用 |
| Escherichia coli BW25113 | 混合酸发酵 | pflA | 丙酮酸甲酸裂解酶激活蛋白 | 催化 | 微好氧条件下上调，促进甲酸生成 |
| Escherichia coli BW25113 | 混合酸发酵 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 微好氧条件下上调，促进乳酸生成 |
| Escherichia coli BW25113 | 混合酸发酵 | adhE | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 微好氧条件下下调，减少乙醇生成 |
| Escherichia coli BW25113 arcA基因敲除突变体 | 全局调控 | arcA | ArcA（缺失） | 调控 | 敲除后TCA循环基因和cyoA表达恢复，乙酸产量降低，但细胞产量下降 |
关键发现
- 在好氧连续培养（稀释率0.2 h⁻¹）中，温度从37°C升至42°C导致特异性葡萄糖摄取速率从2.46±0.05降至2.28±0.04 mmol/gDCW/h（-7.31%），特异性乙酸生产速率从0.18±0.02升至0.32±0.04 mmol/gDCW/h（+77.8%），生物量产率从0.42±0.01降至0.34±0.02 gDCW/g（-19.0%）
- 批式培养中42°C下最大乙酸浓度达2.91 g/L（37°C为2.69 g/L），最终细胞浓度3.32 g/L（37°C为3.92 g/L）。微好氧批式培养中，42°C下乙酸、乳酸、甲酸和琥珀酸产量分别增加28.0%、19.2%、16.0%和50.0%，乙醇产量减少1.3%。基因表达方面，rpoH、dnaK、groL、groS、htpG、ibpB等热激基因显著上调（p<0.1），mlc和arcA上调（p<0.1），ptsG下调（p<0.05），TCA循环基因icdA、sucA、aceA下调（p<0.1或p<0.05），呼吸链cydB上调而cyoA下调。arcA突变株中乙酸产量降低，但细胞产量也下降。
研究结论
温度从37°C升至42°C时，热激通过上调mlc抑制ptsG导致葡萄糖摄取率下降；同时由于高温下溶解氧降低引起arcA上调，抑制TCA循环和呼吸链cyoA，导致乙酸积累增加和细胞产量下降。建议使用arcA基因敲除突变株来减少热激引发的乙酸过量生成，但需注意其会降低细胞产量。