Examining the transcriptional response of overexpressing anthranilate synthase in the hairy roots of an important medicinal plant Catharanthus roseus by RNA-seq
- 作者
- Jiayi Sun, Harish Manmathan, Cheng Sun, Christie A. M. Peebles
- 单位
- Chemical and Biological Engineering Department, Colorado State University; Soil and Crop Sciences Department, Colorado State University; Department of biology, Colorado State University; Key Laboratory of Pollinating Insect Biology of the Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Research, Chinese Academy of Agriculture Science
- 杂志
- BMC Plant Biology（2017）
- DOI
- 10.1186/s12870-016-0794-4
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
过量表达邻氨基苯甲酸合酶（AS）在长春花毛状根中虽能提高色氨酸和色胺等上游代谢物，但下游萜类吲哚生物碱（TIA）产量变化有限，且部分产物下降，其背后的全局转录调控机制尚不清楚。
研究策略
利用已构建的ASαβ-1转基因长春花毛状根系（反馈不敏感ASα亚基受诱导型启动子控制，ASβ亚基组成型表达），通过RT-qPCR分析已知TIA通路基因和调控因子在12、24、48小时的转录变化，并结合RNA-seq对诱导18小时的样本进行转录组测序、de novo组装、差异表达基因鉴定及GO/KEGG/MapMan通路分析。
核心内容
本研究利用已构建的邻氨基苯甲酸合酶（AS）αβ-1转基因长春花毛状根体系，通过RT-qPCR和RNA-seq系统分析了AS过量表达引发的全局转录调控变化。ASα诱导48小时后转录本较未诱导增加60倍，RNA-seq共获得30,281条unigenes，鉴定出2853个差异表达转录本，其中1341个上调、1512个下调；GO富集显示“对刺激响应”为最显著富集生物过程，内源茉莉酸（JA）生物合成通路显著上调。关键TIA通路基因呈现动态变化：TDC在12小时上调最强，DXS、G10H、SLS、LAMT在12小时达峰后回落，STR持续上调，而T19H和MAT在12至48小时显著下调，ORCA3下调而ZCT2高度上调。代谢物方面，诱导72小时后色氨酸、色胺和阿马里新浓度增加，但它波宁、洛钦宁和荷哈默里辛浓度下降；添加马钱苷后catharanthine增加26%、ajmalicine增加84%、tabersonine增加225%。该研究表明AS过表达触发整体应激反应并激活JA信号参与TIA生物合成调控，但T19H和MAT的下调提示JA并非唯一调控机制，TIA合成受到复杂动态的转录调控。
创新点
首次对过量表达AS的长春花毛状根进行系统的RNA-seq转录组分析，揭示AS过表达触发的全局应激反应、内源茉莉酸（JA）生物合成上调以及多条激素信号通路的转录重编程，并发现T19H和MAT下调是导致特定生物碱下降的原因。
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径 | ASa（anthranilate synthase alpha subunit, 拟南芥反馈不敏感型） | Anthranilate synthase alpha subunit | 催化 | 催化分支酸转化为邻氨基苯甲酸，是吲哚途径限速酶；受地塞米松诱导型启动子控制 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径 | ASβ（anthranilate synthase beta subunit） | Anthranilate synthase beta subunit | 催化 | 具有氨基转移酶活性，将谷氨酰胺的氨基转移至α亚基；组成型表达（CaMV 35S启动子） |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 吲哚途径 | TDC | Tryptophan decarboxylase | 催化 | 编码色氨酸脱羧酶，催化色氨酸转化为色胺；AS过表达后12小时转录上调最强 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 莽草酸途径/芳香族氨基酸生物合成 | CM | Chorismate mutase | 催化 | 与AS竞争共同底物分支酸，催化分支酸转化为预苯酸，导向苯丙氨酸和酪氨酸合成；转录水平无明显变化 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 萜类（MEP）途径 | DXS | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase | 催化 | 12小时转录达峰值后快速回落 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 萜类（iridoid）途径 | G10H | Geraniol 10-hydroxylase | 催化 | 12小时转录上调峰值，之后逐渐下降 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 萜类（iridoid）途径 | SLS | Secologanin synthase | 催化 | 12小时转录上调峰值，24小时内快速衰减 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 萜类（iridoid）途径 | LAMT | Loganic acid methyltransferase | 催化 | 12小时上调峰值，衰减速度慢于DXS和SLS |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 生物碱途径（strictosidine合成） | STR | Strictosidine synthase | 催化 | 编码异胡豆苷合酶，48小时诱导期内持续上调 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 生物碱途径（strictosidine下游） | SGD | Strictosidine beta-glucosidase | 催化 | 12小时上调，24小时下调，48小时回到未诱导水平 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 生物碱下游途径（tabersonine分支） | T19H | Tabersonine 19-hydroxylase | 催化 | 12/24/48小时均显著下调，与洛钦宁和荷哈默里辛浓度下降一致 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 生物碱下游途径（tabersonine分支） | MAT | Minovincinine 19-hydroxy-O-acetyltransferase | 催化 | 12/24/48小时均显著下调 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | TIA生物合成调控 | ORCA2 | AP2-domain DNA-binding protein 2 | 调控 | 阳性转录因子，12-48小时高度上调，发挥重要作用 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | TIA生物合成调控 | ORCA3 | AP2-domain DNA-binding protein 3 | 调控 | 阳性转录因子，12和48小时下调，与JA处理时的上调相反 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | TIA生物合成调控 | BPF1 | Box P-binding factor-1 | 调控 | 阳性转录因子，转录水平轻微升高 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | TIA生物合成调控 | MYC2 | MYC2 type basic Helix-Loop-Helix (bHLH) transcription factor | 调控 | 阳性转录因子，转录水平轻微升高 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | TIA生物合成调控 | ZCT2 | Zinc finger Catharanthus transcription factor 2 | 调控 | 阴性转录因子，24和48小时高度上调 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | TIA生物合成调控 | ZCT1 | Zinc finger Catharanthus transcription factor 1 | 调控 | 12小时上调 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | TIA生物合成调控 | ZCT3 | Zinc finger Catharanthus transcription factor 3 | 调控 | 12小时上调 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | TIA生物合成调控 | GBF | G-box binding factor | 调控 | 48小时内转录无变化（阴性/未知调控因子） |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 茉莉酸（JA）生物合成途径 | alpha-linolenic acid metabolism genes | 未具体列出 | 催化 | RNA-seq通路富集显示α-亚麻酸代谢（JA生物合成上游）在上调DEGs中显著富集 |
| Catharanthus roseus hairy roots (ASαβ-1 line) | 植物激素信号转导 | SA/JA signaling genes | 未具体列出 | 调控 | MapMan分析显示SA信号26个DEGs中21个上调，JA信号10个中8个上调；生长素和油菜素内酯信号相关DEGs多数下调 |
关键发现
- ASα诱导48小时后转录本较未诱导增加60倍
- RNA-seq获得30,281条unigenes，平均每个样本约5500万条clean reads
- 共鉴定2853个差异表达转录本（1341个上调、1512个下调）
- 从已知43个TIA通路酶和调控因子中回收39个
- GO富集显示“对刺激响应”是最显著富集的生物过程（p=1.4×10^-30）
- JA生物合成相关α-亚麻酸代谢是上调DEGs显著富集的通路
- RT-qPCR显示TDC在12小时上调最强，DXS、G10H、SLS、LAMT在12小时达峰值后回落，STR在48小时内持续上调，T19H和MAT在12、24、48小时显著下调，ORCA2显著上调，ORCA3在12和48小时下调，ZCT2在24和48小时高度上调
- 代谢物方面，诱导72小时后色氨酸、色胺和阿马里新浓度增加，而它波宁、洛钦宁和荷哈默里辛浓度下降
- 先前报道添加马钱苷后与未喂食AS过表达根相比， catharanthine增加26%，ajmalicine增加84%，lochnericine增加119%，tabersonine增加225%，而色氨酸增加3000%。
研究结论
过量表达AS在长春花毛状根中刺激了整体应激反应并影响代谢网络；内源JA生物合成通路的上调表明JA信号转导参与调控AS工程根中的TIA生物合成，解释了多数TIA基因和调控因子转录增加的原因。但T19H和MAT的下调提示JA不是唯一调控机制，TIA生物合成受到复杂、动态且严格的转录调控。