Expression and functional analysis of citrus carotene hydroxylases: unravelling the xanthophyll biosynthesis in citrus fruits
- 作者
- Gang Ma, Lanciu Zhang, Witchulada Yungyuen, Issei Tsukamoto, Natsumi Iijima, Michiru Oikawa, Kazuki Yamawaki, Masaki Yahata, Masaya Kato
- 单位
- Department of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Agriculture, Shizuoka University, 836 Ohya, Shizuoka, Suruga 422-8529, Japan; The United Graduate school of Agricultural Science, Gifu University (Shizuoka University), Yanagido, Gifu 501-1193, Japan
- 杂志
- BMC Plant Biology（2016）
- DOI
- 10.1186/s12870-016-0840-2
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
柑橘果实中大量积累叶黄素（尤其是β,β-叶黄素），但胡萝卜素羟化酶在调控叶黄素含量和组成中的作用尚不明确。
研究策略
从柑橘基因组中鉴定并克隆四个胡萝卜素羟化酶基因，进行系统发育分析；分析柑橘果实成熟过程中基因表达与类胡萝卜素积累的相关性；利用大肠杆菌异源表达体系对各基因进行功能验证及互作分析。
核心内容
该研究从温州蜜柑基因组中克隆了四个胡萝卜素羟化酶基因（CitHYb、CitCYP97A、CitCYP97B、CitCYP97C），通过系统发育分析、果实成熟期表达谱与类胡萝卜素积累的相关性分析，以及大肠杆菌异源表达体系，系统解析了柑橘果实叶黄素生物合成的分子机制。结果显示，CitHYb是β,β-叶黄素合成的关键羟化酶，其表达随果实成熟上升，与β,β-叶黄素积累一致，且能在体外催化β-胡萝卜素生成β-隐黄质和玉米黄质，果皮中β-隐黄质含量在12月达到49.7 μg/g。研究首次发现CitCYP97C作为ε-环羟化酶，以zeinoxanthin为底物，与CitHYb协同顺序羟基化α-胡萝卜素生成叶黄素。相比之下，CitCYP97A和CitCYP97B在大肠杆菌中未检测到活性，推测前者可能需要辅助因子。该工作阐明了柑橘叶黄素合成的关键酶促步骤，为通过代谢工程改良柑橘营养品质提供了明确的靶点。
创新点
首次从温州蜜柑中分离并鉴定CitCYP97A、CitCYP97B和CitCYP97C；证明CitHYb是β,β-叶黄素生物合成的关键基因；首次发现CitCYP97C作为ε-环羟化酶以zeinoxanthin为底物，与CitHYb协同顺序羟基化α-胡萝卜素生成叶黄素。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素/叶黄素生物合成 | CitHYb | CitHYb | 催化 | 非血红素双铁型β-环羟化酶，催化β-胡萝卜素和α-胡萝卜素的β-环羟基化，生成β-隐黄质、玉米黄质及zeinoxanthin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素/叶黄素生物合成 | CitCYP97C | CitCYP97C | 催化 | 血红素型P450ε-环羟化酶，以zeinoxanthin为底物催化ε-环羟基化生成叶黄素；单独表达无活性，需与CitHYb共表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素/叶黄素生物合成 | CitCYP97A | CitCYP97A | 催化 | 血红素型P450羟化酶，表达模式与叶黄素积累相关，但在E. coli中未检测到羟基化活性 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素/叶黄素生物合成 | CitCYP97B | CitCYP97B | 催化 | 血红素型P450羟化酶，表达水平远低于其他羟化酶基因，可能不是柑橘汁囊中胡萝卜素羟化的关键基因 |
| Citrus unshiu (Satsuma mandarin) | 类胡萝卜素/叶黄素生物合成 | CitLCYe, CitLCYb | LCYe, LCYb | 调控 | 果皮成熟过程中从β,ε-类胡萝卜素积累转为β,β-类胡萝卜素积累，与CitLCYe表达下降和CitLCYb表达上升同步，决定叶黄素水平 |
关键发现
- 在果皮中，β-隐黄质含量在12月达到49.7 μg/g
- CitHYb表达随成熟增加，与β,β-叶黄素积累一致
- CitCYP97A和CitCYP97C在11月出现峰值，与果汁囊中 lutein 增加相关
- CitCYP97B表达量显著低于其他三个基因。功能分析显示，CitHYb可在E. coli BL21(DE3)中催化β-胡萝卜素的β-环羟基化生成β-隐黄质和玉米黄质，也能催化α-胡萝卜素的β-环羟基化生成zeinoxanthin
- CitHYb与CitCYP97C共表达时，α-胡萝卜素被顺序羟基化生成叶黄素
- CitCYP97A和CitCYP97B在大肠杆菌中未检测到羟基化活性。
研究结论
CitHYb是柑橘果实β,β-叶黄素生物合成的关键基因；CitCYP97C是ε-环羟化酶，利用zeinoxanthin为底物合成叶黄素；CitCYP97A可能在叶黄素合成中起作用但其活性可能需要大肠杆菌中缺失的辅助因子。研究结果有助于阐明柑橘果实叶黄素生物合成机制，为改善柑橘营养和商业品质提供新策略。