Co-expression of anti-miR319g and miRStv_11 lead to enhanced steviol glycosides content in Stevia rebaudiana
- 作者
- Monica Saifi, Sneha Yogindran, Nazima Nasrullah, Umara Nissar, Irum Gul, M. Z. Abdin
- 单位
- Centre for Transgenic Plant Development, Department of Biotechnology, School of Chemical and Life Sciences, Jamia Hamdard, Hamdard Nagar, New Delhi 110062, India; School of Life Sciences, Jawaharlal Nehru University, New Delhi 110067, India
- 杂志
- BMC Plant Biology（2019）
- DOI
- 10.1186/s12870-019-1871-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
甜叶菊中甜菊糖苷含量较低且Rebaudioside-A与Stevioside比例不佳，影响甜味剂品质和口感，需要提高目标糖苷含量并优化比例。
研究策略
基于前期已鉴定的两个miRNA（miR319g和miRStv_11），通过构建过表达和anti-miRNA敲低载体，利用农杆菌介导瞬时转化甜叶菊叶片，分别调控关键酶基因表达，并进一步共表达anti-miR319g和miRStv_11以协同提高多种关键酶基因表达，最终提升甜菊糖苷含量。
核心内容
本研究通过农杆菌介导的瞬时转化，在甜叶菊叶片中分别过表达或敲低两个内源miRNA（miR319g和miRStv_11），并进一步共表达anti-miR319g与miRStv_11，以协同调控甜菊糖苷生物合成途径中多个关键酶基因的表达。结果显示，miR319g负调控KO、KS和UGT85C2基因，而miRStv_11通过结合KAH基因启动子区域正向调控KAH表达，后者揭示了miRNA正调控植物基因表达的新机制。共表达处理使成熟miR319g下调9倍、miRStv_11上调15倍，KO、KS、UGT85C2和KAH表达分别升高11.05、6.21、6.85和11.54倍，甜菊苷含量达143.88 mg/g干重（提高24.5%），Rebaudioside-A含量达68.99 mg/g干重（提高51%），Reb A/Stevioside比例由0.39提升至0.47。该策略显著提高了目标糖苷含量并优化了糖苷比例，为甜叶菊品质改良提供了有效途径。
创新点
发现miRStv_11通过结合KAH基因启动子区域正向调控KAH表达，揭示了miRNA正调控植物基因表达的新机制；利用anti-miRNA前体实现miRNA干扰，成功敲低内源miRNA；共表达anti-miR319g和miRStv_11显著提高甜菊苷和Reb A含量，并提高Reb A/Stevioside比例。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Stevia rebaudiana (叶片) | 甜菊糖苷生物合成途径 | miR319g | — | 调控 | 负调控靶基因KO、KS和UGT85C2的表达 |
| Stevia rebaudiana (叶片) | 甜菊糖苷生物合成途径 | miRStv_11 | — | 调控 | 正调控KAH基因表达，通过结合KAH基因启动子区域发挥作用 |
| Stevia rebaudiana (叶片) | 甜菊糖苷生物合成途径 | KO | 贝壳杉烯氧化酶 (Kaurene oxidase) | 催化 | miR319g的靶基因，参与甜菊糖苷合成 |
| Stevia rebaudiana (叶片) | 甜菊糖苷生物合成途径 | KS | 贝壳杉烯合酶 (Kaurene synthase) | 催化 | miR319g的靶基因，参与甜菊糖苷合成 |
| Stevia rebaudiana (叶片) | 甜菊糖苷生物合成途径 | UGT85C2 | UDP-糖基转移酶85C2 (UDP-glycosyltransferase 85C2) | 催化 | miR319g的靶基因，参与甜菊糖苷的糖基化 |
| Stevia rebaudiana (叶片) | 甜菊糖苷生物合成途径 | KAH | 贝壳杉烯酸-13-羟化酶 (Kaurenoic acid-13-hydroxylase) | 催化 | miRStv_11的靶基因，受miRStv_11正调控，被认为是限速酶 |
| Stevia rebaudiana (叶片) | 甜菊糖苷生物合成途径 | anti-miR319g | — | 调控 | 人工构建的anti-miRNA，用于敲低miR319g，解除对靶基因的抑制 |
| Stevia rebaudiana (叶片) | 甜菊糖苷生物合成途径 | anti-miRStv_11 | — | 调控 | 人工构建的anti-miRNA，用于敲低miRStv_11，导致KAH表达下降 |
关键发现
- 过表达miR319g使成熟miR319g表达提高6.5倍，靶基因KO、KS、UGT85C2分别降低11、5、3倍
- 过表达miRStv_11使成熟miRStv_11表达提高13倍，靶基因KAH提高8倍
- anti-miR319g使miR319g降低6.7倍，靶基因KO、KS、UGT85C2分别升高7、5、6倍
- anti-miRStv_11使miRStv_11降低11.6倍，KAH降低8.1倍
- 共表达anti-miR319g和miRStv_11使成熟miR319g下调9倍、miRStv_11上调15倍，靶基因KO、KS、UGT85C2、KAH表达分别升高11.05、6.21、6.85和11.54倍
- 甜菊苷含量达143.88 mg/g叶片干重，较对照提高24.5%
- Rebaudioside-A含量达68.99 mg/g叶片干重，较对照提高51%
- Reb A/Stevioside比例从0.39提高到0.47
- miRStv_11与KAH启动子结合的解溶剂能量（ACE）为-937.59，形成13个氢键。
研究结论
成功验证了miR319g负调控、miRStv_11正调控甜菊糖苷生物合成关键酶基因的机制，并利用anti-miRNA前体实现miRNA干扰。共表达anti-miR319g和miRStv_11可显著提高甜菊糖苷含量和Reb A/Stevioside比例，为甜叶菊品质改良提供了有效策略。