Discovery and characterisation of terpenoid biosynthesis enzymes from Daphniphyllum macropodum
- 作者
- Kaouthar Eljouanidi, Caragh B. Whitehead, Emily Radley, Marissa H. Petrou, Katherine Newling, Sally James, Benjamin R. Lichman
- 杂志
- BMC Plant Biology（2025）
- DOI
- 10.1186/s12870-025-06421-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从非模式植物Daphniphyllum macropodum中发现和表征萜类生物合成酶，探索其未被充分研究的萜类代谢多样性与潜在的新型三萜/生物碱合成关联。
研究策略
结合Oxford Nanopore长读段和Illumina短读段RNA测序构建高质量从头转录组，通过功能注释挖掘萜类合成相关酶基因（PTs、TTCs、TPSs），在本氏烟草中与截短的HMGR或DXS共表达以增强代谢流，利用GC-MS（含手性柱和HS-SPME）进行产物鉴定，并结合系统发育分析酶家族演化。
核心内容
该研究首次结合Oxford Nanopore长读段与Illumina短读段测序，构建了交让木（Daphniphyllum macropodum）高质量从头转录组（BUSCO完整度94.6%），系统挖掘并异源表征了11个萜类合成酶基因，涵盖单萜、倍半萜和三萜合酶。通过在本氏烟草中与截短HMGR2或DXS共表达增强前体供应，结合GC-MS和手性柱进行产物鉴定，发现TPSb1与TPSg4分别产生(R)-和(S)-芳樟醇且隶属不同TPS家族；TPSa3以germacrene D-醇为主要产物，体内外醇/烃比例分别为70:30和90:10。代谢流强化实验显示，共表达截短HMGR2使缬草烯产量提升约7倍，共表达GGPPS1与AtGLS使香叶基芳樟醇产量增加约12倍，TTC1和TTC2使环阿屯醇产量提高约3倍。研究揭示了该物种萜类代谢的化学多样性和酶家族演化特征，为后续交让木属及虎耳草目萜类生物合成与进化研究奠定基础，但未发现直接参与Daphniphyllum生物碱合成的酶。
创新点
首次对D. macropodum进行长/短读长混合转录组测序并系统鉴定其萜类合成酶；发现两个分别产生(R)-和(S)-芳樟醇的萜类合酶（TPSb1和TPSg4）且二者分属不同TPS家族；鉴定出多产物倍半萜合酶TPSa1和TPSa3，后者以germacrene D-醇为主要产物；证实HMGR2能显著提高植物体内萜类产量。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | MVA途径 | HMGR2 | 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶 | 催化 | 使用截短形式（tHMGR），与CnVS共表达使缬草烯产量增加约7倍，用于增强萜类代谢流。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | MEP途径 | DXS2 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 与芳樟醇合酶共表达增加芳樟醇积累，用于增强MEP途径代谢流。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 萜类前体合成 | GGPPS1 (PT3) | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 与AtGLS共表达使香叶基芳樟醇产量增加约12倍，确认为GGPP合酶，位于系统发育树clade V。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 三萜合成 | TTC1 | 环阿屯醇合酶 | 催化 | 与HMGR共表达使环阿屯醇增加约3倍，表达量在四组织中最高。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 三萜合成 | TTC2 | 环阿屯醇合酶 | 催化 | 与HMGR共表达使环阿屯醇增加约3倍。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 三萜合成 | TTC3 | 三萜环化酶（推测羽扇醇合酶） | 催化 | 未检测到活性，但系统发育分析显示与羽扇醇合酶聚类。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 单萜合成 | TPSb1 | (R)-芳樟醇合酶 | 催化 | 产生(R)-芳樟醇，属于TPS-b家族。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 单萜合成 | TPSg4 | (S)-芳樟醇合酶 | 催化 | 产生(S)-芳樟醇，属于TPS-g家族。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 萜类合成 | TPSb2 | 异戊二烯合酶 | 催化 | 与DXS共表达产生异戊二烯。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 单萜合成 | TPSb3 | 多产物单萜合酶 | 催化 | 产生α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、p-薄荷-1(7),8-二烯、α-松油烯等混合单萜。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 倍半萜合成 | TPSg3 | α-愈创木烯合酶 | 催化 | 与DXS共表达产生α-愈创木烯，其NSE/DTE基序存在独特变异（谷氨酸被酪氨酸替换）。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 单萜合成 | TPSg2 | 香叶醇合酶 | 催化 | 与HMGR共表达产生香叶醇及其糖苷。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana) | 倍半萜合成 | TPSa2 | 石竹烯合酶 | 催化 | 与HMGR共表达产生石竹烯。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、大肠杆菌(E. coli) | 倍半萜合成 | TPSa1 | 多产物倍半萜合酶 | 催化 | 在体内和体外均产生germacrene D、α-cubebene、copaene、germacrene D-醇、β-copaen-4-α-醇、4-epi-cubebol等，醇/烃比例约40:60。 |
| 本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、大肠杆菌(E. coli) | 倍半萜合成 | TPSa3 | germacrene D-醇合酶/多产物倍半萜合酶 | 催化 | 主要产生germacrene D-醇，也产生γ-卡丁烯、δ-卡丁烯和τ-卡丁醇；体内外醇/烃比例分别为70:30和90:10。 |
关键发现
- 转录组BUSCO完整度94.6%（1527/1614）
- 鉴定出3个TTCs和10个TPSs
- 共表达截短HMGR2使缬草烯产量增加约7倍
- 共表达GGPPS1（PT3）与AtGLS使香叶基芳樟醇产量增加约12倍
- TTC1和TTC2表达使环阿屯醇产量增加约3倍，TTC3无活性
- TPSb1产生(R)-芳樟醇，TPSg4产生(S)-芳樟醇
- TPSb2产生异戊二烯
- TPSb3产生α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、α-松油烯等
- TPSg3产生α-愈创木烯
- TPSg2产生香叶醇及其糖苷
- TPSa2产生石竹烯
- TPSa1产生germacrene D、α-cubebene、copaene、germacrene D-醇等，醇/烃比例约40:60（体内外）
- TPSa3主要产物为germacrene D-醇（体内外醇/烃比例分别为70:30和90:10）。
研究结论
通过转录组挖掘与异源表达，鉴定并表征了11个新的萜类合成酶（包括单萜、倍半萜和三萜合酶），揭示了D. macropodum萜类代谢的化学多样性，为后续研究该物种及Saxifragales目的萜类生物合成与进化提供了基础，但未发现直接指向Daphniphyllum生物碱生物合成的酶。