高级醇 · 代谢工程文献库

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Establishment and application of highly efficient regeneration, genetic transformation and genome editing system for cucurbitacins biosynthesis in Hemsleya chinensis

作者
Juan Wang, Chao-Hui Li, Chun-Fan Xiang, Pin-Han Zhou, Le-Song Li, Xia Li, Sheng-Chao Yang, Guang-Hui Zhang, Yan Zhao
单位
Key Laboratory of Medicinal Plant Biology of Yunnan Province, National & Local Joint Engineering Research Center on Germplasms Innovation & Utilization of Chinese Medicinal Materials in Southwest China, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; College of Agronomy & Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; Yunnan Characteristic Plant Extraction Laboratory, Kunming, Yunnan 650106, China
杂志
BMC Plant Biology（2024）
DOI
10.1186/s12870-024-05717-x
所属领域
代谢工程
关键词
Genetic transformation systemGenome editingH. chinensisHcOSC6Medicinal plants
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解决的核心问题

雪胆（Hemsleya chinensis）缺乏高效的再生、遗传转化和基因组编辑系统，限制了葫芦素生物合成关键基因功能验证和分子育种。

研究策略

通过优化植物生长调节剂组合（6-BA和NAA）建立高效愈伤组织诱导和芽再生系统，采用农杆菌介导法进行遗传转化，并利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑HcOSC6基因，结合HPLC和转录组分析验证基因功能。

研究路线图

100%
研究问题：雪胆缺乏高效再生/遗传转化/基因组编辑系统
策略：优化激素组合+农杆菌转化+CRISPR/Cas9
关键改造①：建立高效愈伤组织诱导与芽再生体系
关键改造②：农杆菌介导遗传转化体系建立
关键改造③：CRISPR/Cas9靶向编辑HcOSC6基因
结果验证：类型标记+表达水平+代谢物含量检测
结果验证：编辑效率42%与突变体表型分析
结果验证：HcOSC6调控下游基因及代谢流变化
结论：建立雪胆高效遗传操作平台，助力葫芦素分子机制解析与分子育种
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核心内容

本研究针对雪胆缺乏高效再生、遗传转化及基因组编辑体系的问题，优化了6-BA与NAA的植物生长调节剂组合，建立起基于茎段的愈伤组织诱导和芽再生系统，并通过农杆菌介导法实现遗传转化，利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑葫芦素生物合成关键基因HcOSC6。结果显示，茎段愈伤组织诱导率超过95%，芽诱导频率达90%，生根再生率100%，卡那霉素抗性植株确认率高于92%；HcOSC6的编辑效率达42%，获得3个突变株系，其株高均高于野生型。过表达HcOSC6使葫芦二烯醇含量提高2.12倍，而敲除株系中该含量降低1.41倍。转录组分析揭示过表达与敲除株系中分别有4952和4463个差异表达基因，其中下游基因HcCYP87D20、HcCYP81Q58、HcSDR34等在过表达株系中上调、在敲除株系中下调，表明HcOSC6对葫芦素合成通路具有正向调控作用。该研究首次在雪胆中建立了完整的再生、转化与基因组编辑平台，为葫芦素生物合成机制解析和药用植物分子育种提供了有力工具。

创新点

首次在雪胆中建立了高效的再生、遗传转化和基因组编辑系统；实现了对葫芦素生物合成关键酶基因HcOSC6的CRISPR/Cas9编辑，编辑效率达42%；揭示了HcOSC6过表达和敲除对下游葫芦素合成基因的调控作用。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Hemsleya chinensis cucurbitacins biosynthesis HcOSC6 HcOSC6 催化 2,3-氧化鲨烯环化酶，催化2,3-氧化鲨烯环化形成葫芦二烯醇，是葫芦素生物合成的关键酶
Hemsleya chinensis cucurbitacin F biosynthesis HcCYP87D20 HcCYP87D20 催化 下游细胞色素P450酶，在HcOSC6过表达株系中上调，在敲除株系中下调
Hemsleya chinensis cucurbitacin F biosynthesis HcCYP81Q58 HcCYP81Q58 催化 下游细胞色素P450酶，受HcOSC6表达调控
Hemsleya chinensis cucurbitacin F biosynthesis HcSDR34 HcSDR34 催化 下游短链脱氢酶/还原酶，受HcOSC6表达调控
Hemsleya chinensis cucurbitacin F biosynthesis HcCYP87D19 HcCYP87D19 催化 下游细胞色素P450酶，转录组分析中与HcOSC6调控相关
Hemsleya chinensis genome editing Cas9 Cas9 催化 CRISPR/Cas9系统的核酸内切酶，用于靶向编辑HcOSC6基因

关键发现

  1. 茎段愈伤组织诱导率>95%，芽诱导频率达90%，生根再生率100%，卡那霉素抗性植株确认率>92%
  2. CRISPR/Cas9编辑HcOSC6效率为42%，获得3个突变株（ko1、ko3、ko6），株高分别为2.13、2.82、2.11 cm（野生型为1.81 cm）
  3. 过表达HcOSC6使葫芦二烯醇含量提高2.12倍，敲除株系降低1.41倍
  4. 过表达株系中4952个DEGs（2480上调、2472下调），敲除株系中4463个DEGs（2515上调、1948下调）
  5. 下游基因HcCYP87D20、HcCYP81Q58、HcSDR34等在过表达株系中上调、在敲除株系中下调。

研究结论

建立了基于茎段的雪胆高效再生、遗传转化和基因组编辑体系，为解析葫芦素生物合成的分子机制及药用植物分子育种提供了有力平台。