CRISPR/Cas9-mediated editing of carotenoid biosynthesis genes alters carotenoid concentrations in kiwifruit
- 作者
- Xiaoyan Luo, Ying Dou, Yuxuan Lang, Huamei Zhao, Xinling Liu, Xiaoli Zhang, Yuxing Li, Dong Liang, Hui Xia
- DOI
- 10.1186/s12870-025-07112-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
猕猴桃等木本植物遗传转化效率低、耗时长，限制了CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用，进而影响基因功能研究和遗传改良。
研究策略
以猕猴桃'红阳'叶柄为外植体，优化激素浓度和潮霉素筛选浓度，建立快速高效的农杆菌介导遗传转化体系；利用CRISPR/Cas9和PTG/Cas9载体靶向编辑类胡萝卜素合成基因AcPDS和AcZDS，通过表型观察和测序分析突变，并HPLC测定类胡萝卜素含量。
核心内容
本研究以猕猴桃品种‘红阳’叶柄为外植体，通过优化激素组合（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）与潮霉素筛选浓度，建立了农杆菌介导的快速遗传转化体系，将再生周期由传统叶片的10–12周缩短至1–2周。在此基础上，利用CRISPR/Cas9载体（pHSE401）和PTG/Cas9载体（pRGEB32）靶向编辑类胡萝卜素合成基因AcPDS与AcZDS。结果显示，pHSE401-AcPDS转化获得13个PCR阳性株，编辑效率23.07%，其中双等位突变系L13因移码提前终止表现完全白化；pHSE401-AcZDS与pRGEB32-AcZDS的编辑效率分别为25%和60%，后者获得纯合单碱基T缺失的Line10白化株。HPLC测定表明，AcZDS编辑植株叶片总类胡萝卜素含量较野生型降低38%，其中玉米黄质、叶黄素和β-胡萝卜素分别下降56%、63%和57%。该研究不仅验证了双sgRNA载体和PTG系统在猕猴桃中的适用性，还明确了AcZDS对类胡萝卜素积累的关键调控作用，为猕猴桃基因功能解析与品质改良提供了高效技术支撑。
创新点
['首次利用叶柄作为外植体建立了猕猴桃快速遗传转化体系，将再生周期从10-12周缩短至1-2周。', '验证了双sgRNA的pHSE401载体和PTG/Cas9载体在猕猴桃中的编辑适用性，编辑效率超过20%。', '获得了AcPDS和AcZDS基因编辑植株，并明确AcZDS编辑导致类胡萝卜素含量显著下降。']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 猕猴桃（Actinidia chinensis）品种'红阳' | 类胡萝卜素生物合成通路 | AcPDS1, AcPDS2 | 八氢番茄红素脱氢酶（PDS） | 催化 | 类胡萝卜素合成途径关键酶，催化八氢番茄红素脱氢生成ζ-胡萝卜素；突变导致白化矮化 |
| 猕猴桃（Actinidia chinensis）品种'红阳' | 类胡萝卜素生物合成通路 | AcZDS1, AcZDS2 | ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS） | 催化 | 催化ζ-胡萝卜素脱氢生成番茄红素；编辑后类胡萝卜素含量降低 |
关键发现
- 建立了以叶柄为外植体的农杆菌介导转化体系，在MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+10mg/L Hyg条件下，3个月内获得抗性苗
- 叶柄再生出芽仅需1-2周，远快于叶片的10-12周。用pHSE401-AcPDS转化150个叶柄获得16个抗性芽，其中13个PCR阳性，转基因效率81.25%，编辑效率23.07%（4个编辑系/13个阳性），突变类型包括单碱基替换、缺失和双等位突变
- L13为双等位编辑（C→T和A缺失）导致移码和提前终止，表现完全白化
- L10杂合编辑（A→G，苏氨酸→丙氨酸）表现镶嵌白化。用pHSE401-AcZDS转化250个叶柄获得8个抗性芽，4个阳性，转化效率50%，其中1个编辑系（T2位点A→G，苏氨酸→丙氨酸）表现镶嵌白化。用PTG/Cas9系统（pRGEB32-AcZDS）转化660个外植体获得19个抗性芽，转基因效率2.88%，5个阳性中3个突变系，编辑效率60%
- Line10纯合单碱基T缺失导致移码和白化，Line13双等位编辑（C→G和G→C，精氨酸→甘氨酸和脯氨酸），Line15杂合编辑为无义突变产生嵌合体。AcZDS编辑植株叶片总类胡萝卜素含量降低38%，玉米黄质降低56%，叶黄素降低63%，β-胡萝卜素降低57%（与WT相比，P<0.01）。
研究结论
本研究建立了以'红阳'猕猴桃叶柄为外植体的高效遗传转化系统，能显著缩短转化周期。利用该系统结合CRISPR/Cas9和PTG/Cas9系统成功编辑了AcPDS和AcZDS基因，编辑效率超过20%，且AcZDS编辑导致类胡萝卜素含量显著下降，为猕猴桃基因功能研究和遗传改良提供了有效技术体系。