Generation of comprehensive transposon insertion mutant library for the model archaeon, Haloferax volcanii, and its use for gene discovery
- 作者
- Saija Kiljunen, Maria I Pajunen, Kieran Dilks, Stefanie Storf, Mechthild Pohlschroder, Harri Savilahti
- 单位
- 芬兰图尔库大学生物学系遗传学与生理学部门；美国宾夕法尼亚大学生物学系；芬兰赫尔辛基大学生物科学系生物化学与生物技术部门
- 杂志
- BMC Biology（2014）
- DOI
- 10.1186/s12915-014-0103-3
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
模式古菌Haloferax volcanii缺乏高效的随机插入突变方法，限制了对古菌独特代谢途径和基因功能的发现。
研究策略
结合Mu体外DNA转座和基于同源重组的基因靶向，将转座子标记的基因组片段导入H. volcanii，构建全基因组插入突变体文库，并通过筛选色素缺陷和氨基酸营养缺陷型突变体进行基因发现。
核心内容
该研究针对模式古菌Haloferax volcanii缺乏高效随机插入突变方法的问题，采用Mu体外DNA转座与基于同源重组的基因靶向相结合的策略，构建了全基因组转座子插入突变体文库。研究者将转座子标记的基因组片段导入H. volcanii，获得了约28,000个克隆的质粒文库和约7×10^4个插入突变体克隆，Southern分析确认12个检测克隆均为单拷贝插入。通过表型筛选，从34,000个菌落中获得18个色素缺陷突变体，测序表明转座子均插入crtB（HVO_2524）的4个不同位点；从4,100个突变体中鉴定出15个氨基酸营养缺陷型突变体，涉及精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸及缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸和甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸合成基因，其中多个为未注释基因。研究发现未甲基化质粒DNA的转化效率比甲基化形式高10倍，线性DNA转化效率为1×10^4至1×10^5 CFU/μg DNA。该文库成功验证了高效基因发现能力，且策略具有物种非特异性，可推广至其他古菌，为古菌功能基因组学研究提供了重要工具。
创新点
首次为嗜盐古菌建立全基因组随机插入突变体文库；采用MuA体外转座与同源重组结合的策略；发现线性DNA的Dam甲基化状态不影响H. volcanii转化效率；通过表型筛选鉴定了多个未注释基因参与氨基酸合成。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Haloferax volcanii H295 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB (HVO_2524) | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 突变导致色素缺陷，是类胡萝卜素合成第一步关键酶 |
| Haloferax volcanii H295 | 精氨酸生物合成 | argB (HVO_0044) | 乙酰谷氨酸激酶 | 催化 | 精氨酸缺陷突变体 |
| Haloferax volcanii H295 | 精氨酸生物合成 | argC (HVO_0045) | N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶 | 催化 | 两个不同插入位点均导致精氨酸缺陷 |
| Haloferax volcanii H295 | 精氨酸生物合成 | argD (HVO_0043) | 乙酰鸟氨酸氨基转移酶 | 催化 | 精氨酸缺陷突变体 |
| Haloferax volcanii H295 | 精氨酸生物合成 | carA (HVO_2508) | 氨甲酰磷酸合酶小亚基 | 催化 | 精氨酸缺陷突变体 |
| Haloferax volcanii H295 | 组氨酸生物合成 | HVO_0431 | HAD超家族水解酶 | 催化 | 推测参与组氨酸合成，功能未完全鉴定 |
| Haloferax volcanii H295 | 脯氨酸生物合成 | HVO_0869 | 谷氨酸合酶大亚基 | 催化 | 脯氨酸缺陷突变体 |
| Haloferax volcanii H295 | 脯氨酸生物合成 | HVO_1153 | 未知蛋白 | — | 假设蛋白，脯氨酸缺陷突变体，提示新基因 |
| Haloferax volcanii H295 | 酪氨酸生物合成 | HVO_1312 | 预苯酸脱氢酶 | 催化 | 酪氨酸缺陷突变体 |
| Haloferax volcanii H295 | 异亮氨酸生物合成 | leuA1 (HVO_0644) | 2-异丙基苹果酸合酶/(R)-柠檬酸合酶 | 催化 | 支持其参与异亮氨酸合成的假设 |
| Haloferax volcanii H295 | 苯丙氨酸生物合成 | pheA1 (HVO_0449) | 预苯酸脱水酶 | 催化 | 苯丙氨酸缺陷突变体 |
| Haloferax volcanii H295 | 缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成 | ilvC (HVO_1506) | 酮醇酸还原异构酶 | 催化 | 需补充三种氨基酸才能生长 |
| Haloferax volcanii H295 | 缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成 | ilvB1 (HVO_1508) | 乙酰乳酸合酶大亚基 | 催化 | 需补充三种氨基酸才能生长 |
| Haloferax volcanii H295 | 甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢 | thrC3 (HVO_2969) | 苏氨酸合酶 | 催化 | 需补充三种氨基酸才能生长 |
| Escherichia coli | 体外转座 | MuA转座酶 | MuA转座酶 | 催化 | 用于体外DNA转座产生随机插入 |
关键发现
- 构建了包含约28,000个克隆的质粒文库，并生成约7×10^4个H. volcanii插入突变体克隆
- Southern分析证实12个检测克隆均为单拷贝插入。筛选34,000个菌落获得18个色素缺陷突变体，其中15个测序均显示转座子插入crtB（HVO_2524）的4个不同位点。从4,100个突变体中鉴定出15个氨基酸营养缺陷型突变体：精氨酸5个（argB、argC、argD、carA），组氨酸2个（HVO_0431），脯氨酸2个（HVO_0869、HVO_1153），酪氨酸1个（HVO_1312），异亮氨酸1个（leuA1），苯丙氨酸1个（pheA1），另3个分别需要缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸（ilvC、ilvB1）和甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸（thrC3）。线性DNA转化效率为1×10^4至1×10^5 CFU/μg DNA，而未甲基化质粒DNA的转化效率比甲基化高10倍。
研究结论
成功构建了首个嗜盐古菌全基因组插入突变体文库，验证了其高效基因发现能力，且该策略具有物种非特异性，可推广至其他古菌。