Identification and functional evaluation of the reductases and dehydrogenases from Saccharomyces cerevisiae involved in vanillin resistance
- 作者
- Xinning Wang, Zhenzhen Liang, Jin Hou, Xiaoming Bao, Yu Shen
- 单位
- State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University
- 杂志
- BMC Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1186/s12896-016-0264-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
香兰素是木质纤维素预处理过程中产生的酚类抑制剂，对酵母发酵具有毒性。需要鉴定参与香兰素还原和耐受性的关键还原酶/脱氢酶，并阐明其功能机制，以指导菌株改造。
研究策略
基于前期获得的香兰素耐受菌株EMV-8的转录组分析，筛选显著上调的还原酶和脱氢酶，在实验室菌株CEN.PK102-3A中分别过表达这些候选基因，通过发酵实验、酶活测定、辅因子（NADPH/NADP+、NADH/NAD+）及GSH/GSSG比值分析，评价其对香兰素耐受性和解毒能力的贡献。
核心内容
该研究基于香兰素耐受菌株EMV-8的转录组数据，筛选出显著上调的还原酶和脱氢酶基因，并在酿酒酵母CEN.PK102-3A中分别过表达ADH6、YNL134C、YJR096W、ALD6和ZWF1，通过发酵实验、酶活测定及辅因子分析评估其对香兰素解毒和耐受性的贡献。结果表明，过表达ADH6效果最为显著，使菌株在含1 g/L香兰素培养基中的最大比生长速率提高177%，香兰素比还原率提高约8倍，9小时内完全还原香兰素，而对照需40小时；ADH6敲除后还原能力延迟至54小时，提示存在其他还原酶。YNL134C和YJR096W被鉴定为新的香兰素还原酶，分别依赖NADH和NADPH/NADH，但体内贡献受ADH6高背景掩盖。ALD6和ZWF1不直接还原香兰素，而是通过将NADPH/NADP+比值提升至对照的1.96倍和1.55倍并增强GSH/GSSG比值，间接提高抗氧化能力和耐受性。该研究系统阐明了不同基因在香兰素解毒中的直接与间接机制，为改造酵母以增强木质纤维素水解液耐受性提供了策略。
创新点
['鉴定了YNL134C和YJR096W编码的酶具有香兰素还原活性，为新的香兰素还原酶', '阐明ALD6和ZWF1并不直接还原香兰素，而是通过增强NADPH供应和GSH/GSSG比例提高菌株抗氧化能力和香兰素耐受性', '通过比较过表达菌株的香兰素比还原率，揭示了不同酶在体内的真实贡献和底物偏好性']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A | 香兰素还原（转化为香兰醇） | ADH6 | Adh6p | 催化 | NADPH依赖的中链醇脱氢酶，具有广泛的底物特异性，为主要的香兰素还原酶；过表达显著提高香兰素还原率和生长速度 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A | 香兰素还原（转化为香兰醇） | YNL134C | Ynl134c | 催化 | NADH依赖的醛还原酶，体外显示香兰素还原活性，过表达使NADH依赖活性提高至对照的153%，但体内对香兰素比还原率无显著影响 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A | 香兰素还原（转化为香兰醇） | YJR096W | Yjr096w | 催化 | 醛酮还原酶，具有木糖/阿拉伯糖还原酶活性，同时具有NADH和NADPH依赖的香兰素还原活性；过表达使体外NADH和NADPH活性分别提高45%和69%，但体内未显著提高香兰素比还原率 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A | 戊糖磷酸途径 | ZWF1 | Zwf1p | 能量供给 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，催化PPP第一步，产生NADPH；过表达使NADPH/NADP+比值提高至对照的1.96倍，GSH/GSSG比值提高至1.4倍，增强抗氧化能力，但不直接还原香兰素 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A | 乙醛代谢 | ALD6 | Ald6p | 能量供给 | 胞质乙醛脱氢酶，将乙醛转化为乙酸并产生NADPH；过表达使NADPH/NADP+比值提高至对照的1.55倍，GSH/GSSG比值提高至1.8倍，通过增强还原力供应促进香兰素耐受，但不直接还原香兰素 |
关键发现
- 过表达ADH6、ALD6、ZWF1、YNL134C和YJR096W分别使菌株在含1 g/L香兰素培养基中的最大比生长速率(μmax)增加177%、25%、6%、15%和18%
- 过表达ADH6使香兰素比还原率提高约8倍（从0.065 g g^-1 h^-1增至0.584 g g^-1 h^-1），1 g/L香兰素在9小时内被完全还原为香兰醇，而对照需40小时
- ADH6敲除菌株在54小时才完全还原香兰素，证明存在其他还原酶。体外酶活测定显示，过表达ADH6的NADPH依赖香兰素还原活性提高3.5倍，过表达YNL134C的NADH依赖活性为对照的153%，过表达YJR096W的NADH和NADPH依赖活性分别提高45%和69%
- 过表达ZWF1和ALD6使NADPH/NADP+比值分别达到对照的1.96倍和1.55倍，GSH/GSSG比值分别为对照的1.4倍和1.8倍。在含香兰素条件下，过表达YJR096W和YNL134C的乙醇产量比对照高11%。
研究结论
Adh6p是S. cerevisiae中高效但并非唯一的香兰素还原酶；YNL134C和YJR096W编码的酶具有香兰素还原活性，但在体内受Adh6p高背景影响未显著提高比还原率；ALD6和ZWF1通过增强NADPH供应和抗氧化能力间接促进香兰素耐受。过表达这些基因可提高酵母在香兰素存在下的生长和发酵性能，可能为增加木质纤维素水解液耐受性的一般策略。