Role of L-alanine for redox self-sufficient amination of alcohols
- 作者
- Stephanie Klatte, Volker F. Wendisch
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2015）
- DOI
- 10.1186/s12934-014-0189-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
优化全细胞生物催化剂的氧化还原自给醇胺化过程，特别是提高反应温度、更换转氨酶，并阐明L-丙氨酸在其中的作用及宿主丙酮酸代谢对转化效率的影响。
研究策略
将转氨酶从Vibrio fluvialis的TaVf替换为Chromobacterium violaceum的TaCv，构建人工操纵子ald-adh-taCv；在37°C、40°C和42°C下进行全细胞生物转化；通过改变L-丙氨酸浓度、使用丙酮酸代谢缺陷菌株（如YYC202）和单基因敲除菌株（ΔpoxB）来解析L-丙氨酸的消耗途径和功能。
核心内容
本研究针对氧化还原自给型醇胺化全细胞生物催化过程，将转氨酶由来自弧菌的TaVf替换为催化效率更高的紫色色杆菌TaCv，构建人工操纵子ald-adh-taCv并在大肠杆菌中表达。酶动力学显示TaCv的催化效率（Vmax/Km=0.06 U mg⁻¹ mM⁻¹）为TaVf的3倍，42°C下活性高达0.13 U/mg，较后者提升4倍。将反应温度从37°C提至42°C后，1,10-癸二醇胺化生产速率由0.35 mmol/g·h增至1.16 mmol/g·h，提高约3.3倍。通过调节L-丙氨酸浓度及利用丙酮酸代谢缺陷菌株，研究发现L-丙氨酸不仅是氨基供体，还需以至少与底物等摩尔浓度添加才能实现完全转化——无L-丙氨酸时转化率仅5.6%，而20 mM时可达93%。代谢分析表明，L-丙氨酸经脱氨生成的丙酮酸主要由PoxB催化氧化脱羧为乙酸，为细胞提供维持能量；敲除poxB后转化率降至野生型的1/3至1/2，证实PoxB是该条件下丙酮酸分解的主要酶。该工作揭示了辅底物L-丙氨酸在生物转化中的双重功能，为优化全细胞胺化工艺提供了代谢工程策略。
创新点
['用催化效率更高且在42°C活性更高的TaCv替换TaVf，使1,10-癸二醇胺化生产速率提高约4倍', '揭示了L-丙氨酸不仅是氨基供体，还通过PoxB催化的丙酮酸氧化脱羧提供维持能量', '通过基因敲除实验证明PoxB是所选生物转化条件下丙酮酸分解的主要酶']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli W3110 | 醇胺化级联 | ald | alanine dehydrogenase (Ald) | 催化 | 来自Bacillus subtilis，催化丙酮酸还原胺化生成L-丙氨酸并氧化NADH |
| Escherichia coli W3110 | 醇胺化级联 | adh | alcohol dehydrogenase (ADH) | 催化 | 来自Bacillus stearothermophilus，氧化醇生成醛和NADH |
| Escherichia coli W3110 | 醇胺化级联 | taCv | transaminase (TaCv) | 催化 | 来自Chromobacterium violaceum，催化L-丙氨酸的氨基转移至醛 |
| Escherichia coli W3110 | 醇胺化级联 | taVf | transaminase (TaVf) | 催化 | 来自Vibrio fluvialis，原始菌株中的转氨酶，被TaCv替代 |
| Escherichia coli W3110 | 丙酮酸代谢 | poxB | pyruvate oxidase (PoxB) | 催化 | 催化丙酮酸氧化脱羧为乙酸和CO2，产生还原当量，是L-丙氨酸消耗的主要途径 |
| Escherichia coli YYC202 | 丙酮酸代谢 | aceEF, pflB, poxB, pps | pyruvate dehydrogenase complex, pyruvate formate lyase, pyruvate oxidase, phosphoenolpyruvate synthase | 催化 | YYC202缺少这些基因，不能分解丙酮酸，导致转化率降低至42% |
| Escherichia coli BW25113 | 丙酮酸代谢 | poxB | pyruvate oxidase (PoxB) | 催化 | 缺失poxB导致1,10-癸二醇转化率从56%降至16% |
关键发现
- ['TaCv的催化效率（Vmax/Km=0.06 U mg-1 mM-1）是TaVf（0.02 U mg-1 mM-1）的3倍', '在42°C时TaCv的活性（0.13 U/mg）比TaVf（0.03 U/mg）高4倍', '在37°C下，100 mM L-丙氨酸和100 mM NH4Cl时，两种菌株均实现100%转化（1,10-癸二醇→1,10-二氨基癸烷）', '当L-丙氨酸浓度降至50 mM和20 mM时，含TaCv的菌株转化率分别为84%和86%，含TaVf的菌株分别为73%和50%', '无L-丙氨酸时，1,10-二氨基癸烷转化率仅5.6%', 'L-丙氨酸浓度为10 mM和5 mM时，转化率分别为94%和93%', '20 mM L-丙氨酸在无底物时被完全消耗，并产生2 mM乙酸
- 50 mM L-丙氨酸时消耗23 mM并积累16 mM乙酸', '添加20 mM丙酮酸只能达到70%转化率，不能完全替代L-丙氨酸', '使用丙酮酸代谢缺陷菌株YYC202/pTrc99a-ald-adh-taCv转化率为42%，而MG1655参考菌株为100%', '敲除poxB后，W3110ΔpoxB菌株转化率约为野生型的一半，BW25113ΔpoxB菌株转化率（16%）约为野生型（56%）的1/3', '提高反应温度从37°C到42°C，含TaCv菌株的1,10-二氨基癸烷生产速率从0.35 mmol/g·h提高到1.16 mmol/g·h']
研究结论
用TaCv替换TaVf并提高反应温度可显著改善氧化还原自给的醇胺化全细胞生物转化；L-丙氨酸必须以至少与底物等摩尔的浓度添加才能实现完全转化，其消耗主要通过PoxB催化丙酮酸氧化脱羧为乙酸，为细胞提供维持能量；代谢工程证明了PoxB是该条件下丙酮酸分解的主要酶。