Transcriptional reprogramming in yeast using dCas9 and combinatorial gRNA strategies
- 作者
- Emil D. Jensen, Raphael Ferreira, Tadas Jakočūnas, Dushica Arsovska, Jie Zhang, Ling Ding, Justin D. Smith, Florian David, Jens Nielsen, Michael K. Jensen, Jay D. Keasling
- 单位
- The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark; Department of Biology and Biological Engineering, Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Chalmers University of Technology; Department of Genetics, Stanford University School of Medicine; Stanford Genome Technology Center; Joint BioEnergy Institute; Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Department of Chemical and Biomolecular Engineering & Department of Bioengineering, University of California, Berkeley
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2017）
- DOI
- 10.1186/s12934-017-0664-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏可预测、可调的转录控制工具来精确调控酵母内源基因表达，从而难以平衡代谢通量以高效生产异戊二烯类化合物和三酰甘油。
研究策略
利用dCas9融合转录激活因子（VPR）或抑制因子（Mxi1），通过诱导型gRNA和组成型scRNA两种系统，靶向14个酵母启动子进行转录重编程；通过报告基因筛选最佳gRNA，并将其应用于类胡萝卜素和TAG生物合成途径的多基因协同调控。
核心内容
本研究构建了基于dCas9的诱导型和组成型两套转录重编程系统，通过融合VPR激活域或Mxi1抑制域，并设计101种gRNA靶向14个酵母内源启动子，系统评估了两套系统在酿酒酵母中的调控效果。结果显示，在诱导系统中pHMG1表达可被抑制约1.5倍或激活约1.6倍，pOLE1被抑制达2.6倍；组成型系统中最优scRNA可实现约3倍抑制和2.3倍激活，但88个scRNA中仅29个能显著调节基因表达。将筛选出的高效gRNA应用于类胡萝卜素和三酰甘油（TAG）合成途径的多基因协同调控，单gRNA使TAG产量增加1.5倍，双gRNA使产量提高超过2倍，多重调控显著改变β-胡萝卜素含量，且不影响细胞生长。研究还发现gRNA靶向位置与调控效果之间缺乏简单关联。该工作展示了无需基因组编辑即可实现多基因表达精细重编程的可行性，为酵母代谢通量平衡提供了有力工具，同时提示现有gRNA设计规则仍需进一步优化以提高调控的预测性和可编程性。
创新点
系统比较了诱导型与组成型两种dCas9转录调控系统；测试了101种gRNA结构，覆盖14个启动子，鉴定出部分高效gRNA；实现了不依赖基因组编辑的多基因表达重编程，显著改变类胡萝卜素产量和TAG谱；揭示了gRNA位置与调控效果之间缺乏简单关联，提示现有设计规则需优化。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 全细胞 | — | dCas9 | 调控 | 核酸酶缺陷型Cas9，通过gRNA/scRNA靶向结合DNA，用于转录调控 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 转录调控 | — | VPR | 调控 | VP64-p65-Rta转录激活结构域，融合至dCas9或MCP |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 转录调控 | — | Mxi1 | 调控 | 哺乳动物转录抑制结构域，融合至dCas9或PCP |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 转录调控 | — | MCP | 调控 | MS2外壳蛋白，结合scRNA上的MS2茎环，用于招募VPR |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 转录调控 | — | PCP | 调控 | PP7外壳蛋白，结合scRNA上的PP7茎环，用于招募Mxi1 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | FPP合酶，调控其启动子影响异戊二烯前体供应 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | MVA通路/甾醇合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | 竞争FPP分支，抑制其表达可增加类胡萝卜素产量 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | MVA通路 | HMG1 | HMG-CoA还原酶 | 催化 | MVA通路的限速酶，激活可增强通量 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | MVA通路 | HMG2 | HMG-CoA还原酶同工酶 | 催化 | 与HMG1类似，激活用于增加类胡萝卜素 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 脂肪酸/三酰甘油合成 | OLE1 | Δ9-脂肪酸脱饱和酶 | 催化 | 调控其表达影响脂肪酸组成和三酰甘油积累 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 三酰甘油合成 | DGA1 | 二酰甘油酰基转移酶 | 催化 | TAG合成的关键酶，激活促进TAG积累 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 类胡萝卜素合成 | BTS1 | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 将FPP转化为GGPP，用于类胡萝卜素生物合成 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 类胡萝卜素合成 | crtYB | 番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，异源表达 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 类胡萝卜素合成 | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，异源表达 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 脂肪酸合成 | ACC1 | 乙酰辅酶A羧化酶 | 催化 | 组成型激活版本（ACC1**）用于增加丙二酰辅酶A供应 |
关键发现
- 测试了101种gRNA结构覆盖14个启动子
- 在诱导系统中，pHMG1表达被抑制约1.5倍、激活约1.6倍，pOLE1被抑制2.6倍
- 组成系统中pHMG1抑制约1.2倍、激活约1.3倍
- 最佳scRNA可实现约3倍的抑制和2.3倍的激活
- 88个scRNA中29个显著调节基因表达
- pDGA1的gRNA在TSS-139和TSS-58位置激活最高达2倍，pOLE1在TSS-381位置激活达2.5倍
- 单gRNA使TAG产量增加1.5倍，双gRNA使TAG产量提高超过2倍
- 多重调控使β-胡萝卜素含量显著降低（p=8.03E-06），且不影响生长。
研究结论
两种dCas9介导的转录重编程系统性能相似，均可有效实现多基因协同调控，重定向代谢通量以增加类胡萝卜素和TAG产量，且无需基因组编辑。但绝大多数gRNA无效，表明gRNA设计规则和dCas9工程仍需进一步优化。