Presence of protein production enhancers results in significantly higher methanol-induced protein production in Pichia pastoris
- 作者
- Loknath Gidijala, Stefan Uthoff, Sebastiaan J. van Kampen, Alexander Steinbüchel, Raymond M. D. Verhaert
- 单位
- ProteoNic BV, Leiden, The Netherlands; Institut für Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie, Westfälische Wilhelms-Universität Münster, Germany; Hubrecht Institute, KNAW and University Medical Center Utrecht, The Netherlands; Environmental Sciences Department, King Abdulaziz University, Jeddah, Saudi Arabia
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2018）
- DOI
- 10.1186/s12934-018-0961-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高毕赤酵母（Pichia pastoris）中重组蛋白的生产产量，通过引入转录和翻译增强元件。
研究策略
在AOX1启动子上下游引入转录增强子（UNA1、UNA2）和翻译增强子（UNB，即修饰的5'UTR），构建表达盒，结合多拷贝筛选（zeocin抗性）和信号肽序列优化，并在微量培养和16L生物反应器中进行验证。
核心内容
该研究在毕赤酵母中系统评估了转录增强子（UNA1、UNA2）与翻译增强子（修饰的5'UTR，UNB）对甲醇诱导重组蛋白产量的影响，并首次将三者组合为UNall元件。通过构建含不同增强元件组合的表达盒，结合zeocin抗性筛选多拷贝菌株及信号肽序列优化，在微滴板和16L生物反应器中验证了产量提升效果。结果表明，单拷贝UNall表达盒使阿魏酸酯酶A（FAE）产量较无元件对照提高约3倍；经2.0 mg/mL zeocin筛选的多拷贝UNall菌株，FAE产量达到单拷贝参考菌株的12.2倍。信号肽C端EAEA序列仅在单拷贝菌株中使产量提高2倍。人白细胞介素8（hIL8）在微滴板中UNall菌株产量为0.30 g/L，对照为0.18 g/L；放大至16L生物反应器后，UNall菌株hIL8产量约3 g/L，较参考菌株提高10倍，且从微滴板到发酵罐的放大过程中，UNall菌株产量提升幅度（超过10倍）远高于参考菌株（仅2倍）。这证实UNall元件在多拷贝筛选和工业发酵条件下均能稳定提高重组蛋白产量，为毕赤酵母工业化生产提供了有效的表达增强工具。
创新点
首次将转录增强子UNA1/UNA2与5'UTR修饰UNB组合成UNall元件，在微滴板和放大发酵中显著提高重组蛋白产量；多拷贝筛选下产量进一步提升。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢通路（AOX1启动子调控） | AOX1 | 酒精氧化酶AOX1 | 催化 | 甲醇诱导启动子的来源基因，参与甲醇代谢第一步 |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢通路 | faeA | 阿魏酸酯酶A (FaeA) | 催化 | 重组表达的目标酶，来自Aspergillus niger |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢通路 | hIL8 | 人白细胞介素8 (hIL8) | 调控 | 重组表达的目标蛋白，细胞因子，此处作为分泌蛋白产物 |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢通路 | MFA | α-交配因子前导序列 (α-mating factor pre-pro leader) | 转运 | 分泌信号肽，引导蛋白分泌到胞外 |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢通路 | UNA1 | — | 调控 | PAOX1上游激活序列（Adr1p结合位点三拷贝） |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢通路 | UNA2 | — | 调控 | 来自中国仓鼠的转录增强序列 |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢通路 | UNB | — | 调控 | 修饰的5'UTR序列，替代AOX1天然5'UTR以增强翻译 |
关键发现
- 单拷贝UNall表达盒使阿魏酸酯酶A（FAE）产量较无元件对照提高约3倍
- 经2.0 mg/mL zeocin筛选的多拷贝UNall菌株，FAE产量达到单拷贝参考菌株的12.2倍（参考多拷贝为7.9倍）
- 信号肽C端EAEA序列在单拷贝菌株中使产量提高2倍，但在多拷贝菌株中无显著差异
- 人白细胞介素8（hIL8）在微滴板中UNall菌株产量为0.30 g/L，对照为0.18 g/L
- 在16 L生物反应器中，UNall菌株hIL8产量约3 g/L，较参考菌株提高10倍；从微滴板放大到发酵罐，参考菌株产量仅提高2倍，而UNall菌株提高超过10倍。
研究结论
本研究表明，将转录增强子UNA1、UNA2和5'UTR修饰UNB组合成UNall元件能有效提高毕赤酵母重组蛋白产量，且在多拷贝和工业发酵条件下优势保持，为工业化重组蛋白生产提供了新的工具。