高级醇 · 代谢工程文献库

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In situ expression of (R)-carbonyl reductase rebalancing an asymmetric pathway improves stereoconversion efficiency of racemic mixture to (S)-phenyl-1,2-ethanediol in Candida parapsilosis CCTCC M203011

作者
Rongzhen Zhang, Lei Wang, Yan Xu, Hongbo Liang, Xiaotian Zhou, Jiawei Jiang, Yaohui Li, Rong Xiao, Ye Ni
单位
Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education and School of Biotechnology, Jiangnan University; National Key Laboratory for Food Science, Jiangnan University; Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Rutgers University; School of Biotechnology, Jiangnan University
杂志
Microbial Cell Factories（2016）
DOI
10.1186/s12934-016-0539-y
所属领域
代谢工程
关键词
(R)-carbonyl reductase(S)-1-phenyl-1,2-ethanediolCandida parapsilosisIn situ expressionRacemic 1-phenyl-1,2-ethanediolStereoconversion
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解决的核心问题

在近平滑假丝酵母中，(R)-羰基还原酶(RCR)和(S)-羰基还原酶(SCR)协同催化外消旋1-苯基-1,2-乙二醇(PED)转化为(S)-PED，但RCR活性低于SCR导致立体转化效率不高，且生物转化时间长（48小时）。

研究策略

构建用于RCR原位表达的质粒pCP，在C. parapsilosis中过表达RCR以重新平衡RCR和SCR功能；并基于RCR和SCR的最适pH和温度，设计两阶段控制策略（先pH 5.0、30°C促进RCR氧化(R)-PED，再切换至pH 4.5、35°C促进SCR还原2-HAP）。

研究路线图

100%
研究问题
RCR活性低于SCR
导致立体转化效率低
生物转化时间长达48h
策略：
构建pCP质粒原位
表达RCR以平衡
RCR/SCR功能
酶学评价：
RCR活性提高18倍
kcat/Km比值降至1.14
两酶趋于平衡
两阶段控制策略：
先pH5.0/30°C促RCR氧化
再pH4.5/35°C促SCR还原
结果：
13h完成转化
光学纯度98.8%
产率48.4%
结论：
原位表达限速酶RCR
结合两阶段控制
大幅提升立体转化效率
筛选策略优化：
nourseothricin抗性正筛选
+ura3营养缺陷负筛选
表达系统构建：
mal2启动子驱动rcr
act1终止子
sat1/ura3双标记
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核心内容

针对近平滑假丝酵母中RCR活性不足限制外消旋PED向(S)-PED立体转化效率的问题，本研究构建了pCP质粒实现rcr基因的基因组原位表达，以再平衡RCR与SCR的催化功能，并借助nourseothricin抗性和尿嘧啶营养缺陷双重筛选提高阳性克隆效率。重组菌中RCR比活力达0.74 U/mg，较野生型提高约18倍，而SCR活性基本不变；两酶kcat/Km比值由2.03降至1.14，功能趋于平衡。进一步根据两酶最适pH和温度差异设计两阶段控制策略，先于pH 5.0、30°C促进RCR氧化(R)-PED，再切换至pH 4.5、35°C促进SCR还原2-HAP。最终重组菌在13 h内外消旋底物完全转化，(S)-PED光学纯度达98.8%、产率48.4%，生物转化时间由48 h缩短至13 h。该策略通过原位表达限速酶并利用差异调控条件有效再平衡不对称途径，为手性醇的高效生物合成提供了可行方案。

创新点

['首次在C. parapsilosis中建立RCR的原位表达系统，利用pCP质粒实现基因组整合表达', '利用nourseothricin抗性正筛选和尿嘧啶营养缺陷负筛选提高阳性克隆筛选效率', '提出基于pH和温度偏好性的两阶段控制策略，显著缩短生物转化时间并提高光学纯度']

研究对象（7）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Candida parapsilosis CCTCC M203011 (R,S)-PED向(S)-PED的立体转化途径 rcr (R)-羰基还原酶 (RCR) 催化 催化(R)-PED氧化为2-羟苯乙酮(2-HAP)，为限速步骤；原位表达后催化活性显著提高
Candida parapsilosis CCTCC M203011 (R,S)-PED向(S)-PED的立体转化途径 scr (S)-羰基还原酶 (SCR) 催化 催化2-HAP还原为(S)-PED，使用NADPH为辅酶
Escherichia coli DH5α 质粒构建 rcr RCR 调控 用于扩增和验证pCP-rcr质粒
Candida parapsilosis CCTCC M203011 RCR在基因组中的表达调控 mal2 — 调控 mal2启动子用于驱动rcr表达
Candida parapsilosis CCTCC M203011 RCR在基因组中的表达调控 act1 — 调控 act1终止子用于终止rcr转录；act1启动子用于控制sat1表达
Candida parapsilosis CCTCC M203011 筛选标记 sat1 链丝菌素乙酰转移酶 调控 赋予nourseothricin抗性，作为阳性筛选标记
Candida parapsilosis CCTCC M203011 筛选标记 ura3 — 调控 利用ura3营养缺陷作为负筛选标记

关键发现

  1. 重组C. parapsilosis/pCP-RCR催化(R)-PED氧化为2-HAP的比活力为0.74 U/mg，较野生型（0.04 U/mg）提高约18倍
  2. 而SCR催化2-HAP生成(S)-PED的活性保持不变（0.40 U/mg vs 0.39 U/mg）。动力学参数表明，RCR的kcat/Km由0.29提高到0.51 s⁻¹ mM⁻¹，SCR与RCR的kcat/Km比值由2.03降至1.14，两酶功能趋于平衡。采用两阶段控制策略后，重组菌在13 h内外消旋PED转化为(S)-PED，光学纯度98.8%、产率48.4%（基于50%理论收率，实际转化率达98.4%），生物转化时间由48 h缩短至13 h。

研究结论

通过原位表达限速酶RCR并采用两阶段pH和温度控制策略，有效再平衡了RCR和SCR介导的不对称生物合成途径，大幅提高了外消旋PED向(S)-PED的立体转化效率和光学纯度，为手性生物合成提供了新方法。