Engineering of leucine-responsive regulatory protein improves spiramycin and bitespiramycin biosynthesis
- 作者
- Zhili Lu, Xiaoting Zhang, Jianlu Dai, Yiguang Wang, Weiqing He
- 单位
- NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, No. 1 Tian Tan Xi Li, Beijing 100050, People's Republic of China; State Key Laboratory of Respiratory Disease, Guangzhou Regenerative Medicine and Health Guangdong Laboratory, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510530, China
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2019）
- DOI
- 10.1186/s12934-019-1086-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明亮氨酸响应调控蛋白SSP_Lrp对螺旋霉素（SP）和必特螺旋霉素（BT）生物合成的调控机制，并通过改造该调控蛋白提高目标产物产量，尤其是III组分的比例。
研究策略
通过基因敲除、C端推测L-亮氨酸结合域删除、过表达、电泳迁移率变动分析（EMSA）、转录组测序及qPCR等方法，研究SSP_Lrp对SP/BT生物合成基因和支链氨基酸代谢的调控作用，进而构建高产菌株。
核心内容
该研究以螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramycticus 1941为对象，通过基因敲除、过表达、EMSA、转录组测序及qPCR等手段，阐明了亮氨酸响应调控蛋白SSP_Lrp对螺旋霉素（SP）和必特螺旋霉素（BT）生物合成的调控机制。研究发现SSP_Lrp是SP/BT生物合成的负调控因子，可直接结合正调控基因bsm23、bsm42及acyB2的启动子。删除SSP_Lrp C端推测的L-亮氨酸结合域后，SP产量提高至476.2 μg/L，约为野生型的1.5倍，SP III组分比例从24.4%升至33.0%；BT产量提高约2.96倍，ISP III组分比例从4.2%升至8.4%。转录组分析显示，PKS基因、酰基辅酶A代谢及天冬氨酸1-脱羧酶等基因显著上调，胞内支链氨基酸浓度明显下降，表明该调控蛋白通过调节支链氨基酸分解代谢增强丙酰辅酶A等前体供给。该研究揭示了SSP_Lrp的双重调控作用，为工业高产菌株改造提供了新策略。
创新点
发现SSP_Lrp是SP/BT生物合成的负调控因子；删除其C端假定L-亮氨酸结合域可显著提高SP和BT产量，并提升SP III和ISP III组分比例；揭示了SSP_Lrp通过调节支链氨基酸分解代谢影响前体供给的调控机制。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 螺旋霉素/必特螺旋霉素生物合成 | orf2 (ssp_lrp) | SSP_Lrp | 调控 | Lrp家族全局调控因子，负调控SP/BT生物合成，直接结合bsm23、bsm42和acyB2启动子 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 螺旋霉素/必特螺旋霉素生物合成调控 | bsm23 | Bsm23 | 调控 | 正调控基因，srm22同源基因，启动子含Lrp结合基序 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 螺旋霉素/必特螺旋霉素生物合成调控 | bsm42 | Bsm42 | 调控 | 正调控基因，srm40同源基因，启动子含Lrp结合基序 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 必特螺旋霉素生物合成调控 | acyB2 | AcyB2 | 调控 | 正调控基因，调控ist基因转录，启动子含Lrp结合基序 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 必特螺旋霉素生物合成 | ist | 4''-O-异戊酰转移酶 | 催化 | 来自Streptomyces thermotolerans的异源基因，催化4''-O-异戊酰化 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 螺旋霉素生物合成 | comp4553 (PKS gene) | I型聚酮合酶（KS域） | 催化 | 转录组显示上调，qPCR验证表达提高6.34倍 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 酰基辅酶A代谢 | comp8771 | 酰基辅酶A硫酯酶 | 催化 | 上调5.72倍，参与酰基辅酶A代谢 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 天冬氨酸代谢 | comp9112 | 天冬氨酸1-脱羧酶 | 催化 | 上调11.47倍，参与β-丙氨酸合成 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 丙酮酸代谢 | comp4959 | TPP依赖性丙酮酸脱氢酶 | 催化 | 上调4.6倍 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 异戊二烯生物合成 | comp1450 | 异戊二烯生物合成水解酶 | 催化 | 上调2.5倍 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | Sigma因子调控 | comp5288 | Sigma24家族因子 | 调控 | 上调3.6倍 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 核糖体生物合成 | comp1000 | 核糖体蛋白S8 | 调控 | 下调基因，编码核糖体蛋白S8 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 核糖体生物合成 | comp7405 | 核糖体蛋白S7 | 调控 | 下调基因，编码核糖体蛋白S7 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 萜类生物合成 | comp10453 | 细胞色素P450 | 催化 | 下调基因，参与倍半萜和三萜生物合成 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 氮代谢 | comp4083 | 谷氨酰胺合成酶 | 催化 | 下调基因 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 氮代谢 | comp9736 | 谷氨酸合酶 | 催化 | 下调基因 |
| Streptomyces spiramycticus 1941 | 多药外排调控 | comp1697 | AcrR家族转录调控因子 | 调控 | 下调5.1倍，可能通过AcrAB外排泵影响耐药性 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 异源蛋白表达 | ssp_lrp | His6-SSP_Lrp | 调控 | 用于表达纯化SSP_Lrp蛋白进行EMSA |
关键发现
- SP产量：ΔSSP_Lrp-SP菌株为476.2±3.1 μg/L，野生型S. spiramycticus 1941为313.3±25.2 μg/L，提高约1.5倍
- SP III比例从野生型的24.4%提高至33.0%。BT产量：ΔSSP_Lrp-BT菌株的ISP总产量为17.5±0.1 μg/L，1941-BT为5.9±0.3 μg/L，提高约2.96倍
- ISP III比例从4.2%提高至8.4%。胞内支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）浓度分别从65.1±5.6、62.6±5.1、25.1±2.5 μg/g降至32.0±4.1、37.8±9.5、13.5±3.2 μg/g。转录组/qPCR显示comp4553（PKS基因）上调6.34倍、comp8771（酰基辅酶A代谢）上调5.72倍、comp9112（天冬氨酸1-脱羧酶）上调11.47倍
- TPP依赖性丙酮酸脱氢酶上调4.6倍，Sigma24家族因子上调3.6倍，异戊二烯生物合成相关水解酶上调2.5倍。
研究结论
SSP_Lrp是S. spiramycticus中SP和BT生物合成的负调控因子，通过直接结合bsm23、bsm42和acyB2等正调控基因的启动子发挥作用。删除其假定L-亮氨酸结合域可增强支链氨基酸分解代谢，提供更多丙酰辅酶A等前体，从而显著提高SP和BT产量及III组分比例，为工业高产菌株改造提供了新策略。