高级醇 · 代谢工程文献库

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Direct pathway cloning of the sodorifen biosynthetic gene cluster and recombinant generation of its product in E. coli

作者
Elke R. Duell, Paul M. D'Agostino, Nicole Shapiro, Tanja Woyke, Thilo M. Fuchs, Tobias A. M. Guldert
单位
Biosystems Chemistry, Department of Chemistry and Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Technical University of Munich; Department of Energy, Joint Genome Institute; ZIEL Institute for Food & Health, Lehrstuhl für Mikrobielle Ökologie, Department biowissenschaftliche Grundlagen, Technical University of Munich; Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Molekulare Pathogenese; Chair of Technical Biochemistry, Technische Universität Dresden
杂志
Microbial Cell Factories（2019）
DOI
10.1186/s12934-019-1080-6
所属领域
代谢工程/合成生物学
关键词
DiPaCGenome miningHeterologous expressionSerratia plymuthicaSodorifenTerpenes
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解决的核心问题

天然产生菌Serratia plymuthica中sodorifen产量低且VOCs背景复杂，难以进行功能研究，需要建立高效异源生产系统并验证sodorifen生物合成基因簇（BGC）的功能。

研究策略

利用全基因组测序和antiSMASH分析鉴定S. plymuthica WS3236中的候选sodorifen BGC，采用直接通路克隆（DiPaC）技术将4.6 kb的sodA-D基因簇克隆到tetracycline诱导型表达载体pET28b-ptetO中，转化E. coli BL21进行异源表达，并优化培养基（LB、TB、succDMM）提高产量。

研究路线图

100%
研究问题: sodorifen天然产量低, 难以功能研究
策略: 全基因组测序+antiSMASH鉴定BGC
策略: DiPaC克隆4.6kb sodA-D基因簇
关键改造: 构建pET28b-ptetO载体转化E. coli
关键改造: GFP验证转录翻译+培养基优化
结果: 产量提升26倍, 产物纯度高
结果: GC-MS确认sodorifen 纯净VOC谱系
结论: 高效异源生产系统建立, 挖掘28个类似BGC
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核心内容

本研究针对天然产生菌粘质沙雷氏菌WS3236中sodorifen产量低且挥发性有机物背景复杂的问题，利用全基因组测序与antiSMASH分析鉴定出包含sodA-D四个基因、长度4.6 kb的候选生物合成基因簇，并采用直接通路克隆技术将该基因簇克隆至四环素诱导型载体pET28b-ptetO中，转化大肠杆菌BL21实现异源表达。通过GFP报告基因验证了基因簇的完整转录翻译，并在LB、TB、succDMM三种培养基中优化产量。结果显示，异源菌株在TB培养基中第3至4天产量最高，相对GC-MS峰面积达1003至1018，较天然产生菌最佳条件提高约26倍；分离产量在24小时内为6.4至7.9毫克，四天总产量达13.4至25.5毫克，且产物经GC-MS确认为sodorifen（m/z 218），异源表达体系中背景挥发物显著减少。该工作成功建立了高产且谱系干净的sodorifen异源生产平台，为深入研究sodorifen生物学功能及挖掘sod-like基因簇编码的新型萜类化合物奠定了基础，同时也验证了直接通路克隆在次级代谢产物异源表达中的有效性。

创新点

首次通过DiPaC实现整个sod BGC在E. coli中的高效异源表达；利用GFP报告基因验证整个簇的转录翻译；通过培养基优化使sodorifen产量较天然产生菌提高约26倍；通过基因组挖掘发现28个sod-like基因簇并分类为8组。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21 sodorifen生物合成通路（MEP途径衍生） sodA, sodB, sodC, sodD SodA (isopentenyl-diphosphate delta-isomerase), SodB (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase), SodC (SAM-dependent C-methyltransferase/cyclase), SodD (terpene cyclase) 催化 异源表达宿主，通过DiPaC导入完整sod BGC，受Pte_tO启动子调控
Serratia plymuthica WS3236 sodorifen生物合成通路（MEP途径衍生） sodA, sodB, sodC, sodD SodA, SodB, SodC, SodD 催化 天然产生菌，全基因组测序发现38个BGC，包括候选sodorifen BGC
Serratia plymuthica 4Rx13 sodorifen生物合成通路 sodA-D SodA, SodB, SodC, SodD 催化 参考文献中已表征的sodorifen BGC来源菌株，与WS3236同源性高

关键发现

  1. S. plymuthica WS3236基因组包含38个BGC，其中4.6 kb的sodA-D为候选sodorifen BGC
  2. 异源表达E. coli BL21 pET28b-ptetO::sod_gfpv2在TB培养基中第4天产量最高，比天然产生菌最佳条件（TB第1天）提高26倍
  3. 相对产量（基于GC-MS峰面积）在重复中为232-318（第1天）和1003-1018（第3-4天）
  4. 分离产量在24小时内为6.4-7.9 mg，4天总产量13.4-25.5 mg
  5. GC-MS确认产物为sodorifen（m/z 218），且异源表达VOC谱系干净，主要产物为sodorifen。

研究结论

成功建立了基于E. coli的高产sodorifen异源表达系统，显著提高产量和纯度，为研究sodorifen的生物学功能及挖掘sod-like BGC编码的新型萜类化合物奠定了基础。