Investigation of the methylerythritol 4-phosphate pathway for microbial terpenoid production through metabolic control analysis
- 作者
- Daniel Christoph Volke, Johann Rohwer, Rainer Fischer, Stefan Jennewein
- 单位
- Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Aachen, Germany; The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark, Kongens Lyngby, Denmark; Laboratory for Molecular Systems Biology, Department of Biochemistry, Stellenbosch University, Stellenbosch, South Africa; Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, West Lafayette, USA
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2019）
- DOI
- 10.1186/s12934-019-1235-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
MEP途径的调控机制不清楚，导致利用该途径进行微生物萜类化合物生产的代谢工程改造效果不佳，缺乏定量描述。
研究策略
将代谢控制分析（MCA）应用于大肠杆菌中表达异源异戊二烯合酶（ispS）的MEP途径；通过重组工程随机化dxs基因的核糖体结合位点（RBS）构建表达文库以扰动途径；结合靶向蛋白质组学和代谢组学定量测定酶浓度、代谢物浓度和通量，计算控制系数。
核心内容
该研究将代谢控制分析（MCA）应用于大肠杆菌中异源表达异戊二烯合酶（IspS）的甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径，旨在定量解析该途径的调控机制。通过重组工程随机化dxs基因的核糖体结合位点构建表达文库扰动途径，并结合靶向蛋白质组学、代谢组学及非稳态13C通量分析，测定了酶浓度、代谢物浓度与通量的关系并计算控制系数。结果显示异源IspS表达导致IPP/DMAPP积累并抑制生长，与idi共表达可恢复；Dxs的通量控制系数为0.35，对DXP通量的控制系数为0.65，但过表达后控制减弱。研究还发现MECPP浓度随dxs过表达急剧上升（浓度控制系数为2.6），IspG消耗MECPP的反应趋于饱和，成为通量限制步骤，同时MECPP外排率与dxs表达水平呈对数斜率约2.0的正相关，造成碳流失。该研究首次将重组工程与组学定量结合实现MEP途径的精确代谢控制分析，明确了Dxs、Idi和IspG是关键工程靶点，指出提升IspG/IspH活性并抑制代谢物外排是提高微生物萜类生产效率的关键方向。
创新点
首次将重组工程与靶向蛋白质组学和代谢组学相结合，实现对特定代谢途径的精确代谢控制分析；定量揭示了Dxs对MEP途径通量和代谢物浓度的控制，并发现IspG饱和及MECPP外排是限制因素。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP pathway | dxs | Dxs | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶，MEP途径第一个限速酶，通量控制系数0.35 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP pathway | idi | Idi | 催化 | 异戊烯基二磷酸异构酶，催化IPP与DMAPP互变，共表达可恢复ispS造成的生长抑制 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP pathway | ispS | IspS | 催化 | 来自Populus alba的异戊二烯合酶，以DMAPP为底物生成异戊二烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP pathway | ispG | IspG | 催化 | HMBPP合酶，将MECPP转化为HMBPP，是通量限制步骤，易饱和 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP pathway | ispH | IspH | 催化 | HMBPP还原酶，生成IPP和DMAPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP pathway | dxr | Dxr | 催化 | DXP还原异构酶，构建了表达文库但未观察到异戊二烯产量变化 |
关键发现
['异源表达异戊二烯合酶（ispS）导致E. coli中IPP/DMAPP积累且严重抑制生长，与idi共表达后恢复生长并回至野生型IPP/DMAPP水平。', '通过代谢控制分析，Dxs的通量控制系数为0.35（Dxs活性增加1%，MEP途径通量增加0.35%）。', '在dxs过表达时，MECPP浓度急剧上升，其浓度控制系数为2.6，而DXP、MEP、ME-CDP呈线性依赖。', 'IspG消耗MECPP的反应饱和，成为限制通量流向异戊二烯的步骤。', 'MECPP在胞内积累导致其外排至培养基中，外排率与dxs表达水平相关，对数斜率约为2.0。', 'Dxs对DXP通量的控制系数为0.65。', '通过非稳态13C通量分析，MEP途径通量随dxs表达增加而增加。']
研究结论
Dxs、Idi和IspG是MEP途径工程改造的重要靶点，其中Dxs在野生型水平下对异戊二烯生产有显著控制（控制系数0.35），但过表达后控制减弱；MECPP还原为HMBPP的步骤（IspG/IspH）是通量限制环节，且MECPP外排导致碳流失。进一步提高IspG/IspH活性并抑制代谢物外排是实现高效萜类生产的关键。