Enhanced production of taxadiene in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Behnaz Nowrouzi, Rachel A. Li, Laura E. Walls, Leo d'Espaux, Koray Malci, Lungang Liang, Nestor Jonguitud-Borrego, Albert I. Lerma-Escalera, Jose R. Morones-Ramirez, Jay D. Keasling, Leonardo Rios-Solis
- 单位
- Institute for Bioengineering, School of Engineering, The University of Edinburgh; Centre for Synthetic and Systems Biology (SynthSys), The University of Edinburgh; DOE Joint BioEnergy Institute; Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Centro de Investigacion en Biotecnologia y Nanotecnologia, Facultad de Ciencias Quimicas, Universidad Autonoma de Nuevo Leon; Departments of Chemical & Biomolecular Engineering and of Bioengineering, University of California, Berkeley; Center for Biosustainability, Danish Technical University; Center for Synthetic Biochemistry, Institute for Synthetic Biology, Shenzhen Institutes for Advanced Technologies
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2020）
- DOI
- 10.1186/s12934-020-01458-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇前体紫杉二烯在酿酒酵母中产量低，主要瓶颈是紫杉二烯合酶（TASY）在酵母中表达量低且溶解性差。
研究策略
通过多拷贝染色体整合、融合蛋白标签（MBP、GFP）和ERG20融合蛋白提高TASY表达与溶解性，同时优化启动子、培养温度和镁离子浓度等条件，并实现从微尺度到250 mL生物反应器的放大。
核心内容
针对紫杉醇前体紫杉二烯在酿酒酵母中产量低的问题，本研究系统分析了瓶颈在于紫杉二烯合酶（TASY）表达量低且溶解性差。通过多拷贝染色体整合TASY并融合MBP和GFP标签，紫杉二烯产量提高22倍，达到57±3 mg/L（30°C微尺度培养）；进一步采用ERG20*融合策略同时增加前体供给和改善TASY溶解性，在20°C下最优菌株摇瓶产量达129±15 mg/L，生物反应器产量为127 mg/L，TASY活性较文献报道提高6.5倍。研究还发现降低培养温度从30°C到20°C可使游离表达产量提高3.0倍（8 vs 2.7 mg/L），截短60个氨基酸残基的TASY变体产量较全长提高约2倍。副产物GGOH在生物反应器中降至4-5 mg/L，表明代谢流更高效地导向目标产物。该工作揭示了TASY溶解性是关键瓶颈，通过蛋白工程与发酵条件优化的协同策略显著提升了紫杉二烯产量及放大可行性，为紫杉醇微生物合成途径的进一步完善奠定了基础。
创新点
揭示了TASY在酿酒酵母中溶解性差是合成紫杉二烯的关键瓶颈；通过多拷贝染色体整合和融合标签将紫杉二烯产量提高22倍；采用ERG20*融合策略同时增加前体供给和改善TASY溶解性；验证了低温和生物反应器放大的可行性。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 紫杉二烯生物合成通路（甲羟戊酸途径） | TASY | 紫杉二烯合酶（Taxadiene synthase） | 催化 | 来自Taxus cuspidata，催化GGPP环化生成taxadiene；通过截短60残基和融合MBP/GFP标签提高溶解性和产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径（前体供给） | ERG20 | 法尼基二磷酸合酶（Farnesyl pyrophosphate synthase） | 催化 | 突变体ERG20*（F96C）被改造为香叶基香叶基二磷酸合酶，提高GGPP前体供给；与TASY融合表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径（前体供给） | crtE | 香叶基香叶基二磷酸合酶（GGPP synthase） | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，用于从FPP合成GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | mvaE | 乙酰-CoA乙酰转移酶（Acetyl-CoA acetyltransferase） | 催化 | 来自Enterococcus faecalis，催化乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | mvaS | 羟甲基戊二酰-CoA合酶（HMG-CoA synthase） | 催化 | 来自Enterococcus faecalis，催化乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合为HMG-CoA |
关键发现
- 多拷贝染色体整合TASY并融合MBP和GFP标签后，紫杉二烯产量提高22倍，达到57±3 mg/L（30°C微尺度培养）
- 在20°C下最优菌株摇瓶产量为129±15 mg/L，生物反应器产量为127 mg/L
- 相比文献中酿酒酵母最高产量，TASY活性提高6.5倍
- 截短60个氨基酸残基的TASY变体产量为13.0±0.8 mg/L，较全长提高约2倍
- 降低培养温度从30°C到20°C使游离表达产量提高3.0倍（8±0.1 mg/L vs 2.7±0.2 mg/L）
- 摇瓶中20°C和30°C下GGOH副产物分别为19±3和35±1 mg/L，生物反应器中降至4和5 mg/L。
研究结论
通过多拷贝染色体整合、融合蛋白标签和培养条件优化，显著提高了酿酒酵母中紫杉二烯的产量和可放大性，为紫杉醇微生物合成途径的进一步开发奠定了基础。