Integration of a multi-step heterologous pathway in Saccharomyces cerevisiae for the production of abscisic acid
- 作者
- Maximilian Otto, Paulo Gonçalves Teixeira, Maria Isabel Vizcaino, Florian David, Verena Siewers
- 单位
- Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Department of Biology and Biological Engineering, Chalmers University of Technology, Gothenburg, Sweden; Chalmers Mass Spectrometry Infrastructure, Chalmers University of Technology, Gothenburg, Sweden
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2019）
- DOI
- 10.1186/s12934-019-1257-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中建立异源脱落酸(ABA)生物合成途径，实现ABA的微生物生产，并解决途径通量瓶颈。
研究策略
将灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的ABA合成基因簇(bcaba1-4等)密码子优化后整合到不同遗传背景的酿酒酵母基因组中，通过比较不同底盘、过表达细胞色素P450还原酶、筛选途径中间体和额外拷贝关键基因等手段，鉴定并解除瓶颈。
核心内容
本研究将灰葡萄孢来源的脱落酸合成基因簇（bcaba1-4等）密码子优化后整合至酿酒酵母基因组，首次在酵母中实现了完整的多步异源ABA生物合成途径。实验通过比较不同底盘菌株、过表达细胞色素P450还原酶、以及额外引入关键基因拷贝来定位通量瓶颈。结果显示，仅表达bcaba1234四个基因即可合成ABA，其中BcABA1和BcABA2是限速环节；额外表达bcaba1和bcaba2使最终菌株S3S12的ABA产量达到11 mg/L，相比对照提高4.1倍，碳产量为0.558 mg ABA/g葡萄糖。此外，研究鉴定到新的途径相关中间体MZ233（m/z 233.1539），其积累可通过增强BcABA2活性而减少，ABA与MZ233的离子计数比在优化菌株中达到7.2。这项工作证实了在酿酒酵母中异源生产ABA的可行性，通过表达平衡和提升CYP活性有效解除了途径瓶颈，为后续构建高效ABA细胞工厂奠定了理论基础。
创新点
['首次在酿酒酵母中实现多步异源ABA途径的功能表达', '证实bcaba1-4四个基因足以在酵母中合成ABA，bcaba5非必需', '发现BcABA1和BcABA2是途径瓶颈，通过额外表达使ABA产量提高4.1倍', '鉴定到一个新的ABA途径相关中间体MZ233（m/z 233.1539）']
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 甲羟戊酸途径/ABA合成途径 | — | — | 催化 | 野生型底盘菌株，用于构建DABA1等 |
| Saccharomyces cerevisiae 5D-tHMG1 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达截短HMG1以增强MVA途径通量，作为TABA系列菌株背景 |
| Saccharomyces cerevisiae SCIGS22a | 甲羟戊酸途径/ABA合成途径 | ERG20, tHMG1, GDH2 | FPP合酶, 截短HMG-CoA还原酶, NADH依赖性谷氨酸脱氢酶 | 能量供给 | 平台菌株，通过删除LPP1/DPP1、动态调控ERG9、删除GDH1并过表达GDH2来增加FPP和NADPH供应 |
| Saccharomyces cerevisiae | ABA合成途径 | bcaba1 | BcABA1 | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，催化α-ionylideneethane氧化为α-ionylideneacetic acid，途径瓶颈之一 |
| Saccharomyces cerevisiae | ABA合成途径 | bcaba2 | BcABA2 | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，催化α-ionylideneacetic acid氧化为1',4'-trans-dihydroxy-α-ionylideneacetic acid，途径瓶颈之一 |
| Saccharomyces cerevisiae | ABA合成途径 | bcaba3 | BcABA3 | 催化 | 催化FPP环化形成ABA核心骨架α-ionylideneethane，功能与STC相关 |
| Saccharomyces cerevisiae | ABA合成途径 | bcaba4 | BcABA4 | 催化 | 短链脱氢酶/还原酶，参与ABA合成但非必需 |
| Saccharomyces cerevisiae | ABA合成途径 | bcaba5 | BcABA5 | 催化 | 推测的倍半萜环化酶，在酵母中对ABA合成非必需，无正向作用 |
| Saccharomyces cerevisiae | ABA合成途径 | bcccP450 | BcccP450 | 催化 | 推测的细胞色素P450，与ABA合成共表达，但在酵母中无正向作用 |
| Saccharomyces cerevisiae | ABA合成途径 | bccpr1 | BcCPR1 | 能量供给 | 灰葡萄孢NADPH-细胞色素P450还原酶，为CYP提供电子，过表达可提高ABA产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | ABA合成途径 | NCP1 | Ncp1 | 能量供给 | 内源NADPH-细胞色素P450还原酶，过表达可替代BcCPR1，但导致生长下降 |
关键发现
- 表达bcaba1234即可在酿酒酵母中产生ABA
- TABA1菌株ABA产量最高约4.7 mg/L，DABA1和SABA1约4 mg/L
- 过表达内源NCP1或异源BcCPR1使产量提高3.5倍（TABA3/TABA5 vs TABA6）
- 额外表达bcaba1使ABA产量提高2.4倍，bcaba2或bcaba3提高1.3倍，bcaba4无显著效果
- 同时表达bcaba1和bcaba2的S3S12菌株ABA产量达到11 mg/L，比对照提高4.1倍，碳产量为0.558 mg ABA/g葡萄糖
- MZ233（m/z 233.1539）被鉴定为途径中间体或副产物，BcABA2活性增加可减少其积累，ABA:MZ233离子计数比在S3S2中达到7.2。
研究结论
本研究首次证明了在酿酒酵母中通过灰葡萄孢的四酶途径异源生产ABA的可行性，通过表达平衡和增加CYP活性可将产量提高4.1倍并减少副产物，为未来ABA细胞工厂的构建奠定了基础。