高级醇 · 代谢工程文献库

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Production of ent-kaurene from lignocellulosic hydrolysate in Rhodosporidium toruloides

作者
Gina M. Geiselman, Xun Zhuang, James Kirby, Mary B. Tran-Gyamfi, Jan-Philip Prahl, Eric R. Sundstrom, Yuqian Gao, Nathalie Munoz Munoz, Carrie D. Nicora, Derek M. Clay, Gabriella Papa, Kristin E. Burnum-Johnson, Jon K. Magnuson, Deepti Tanjore, Jeffrey M. Skerker, John M. Gladden
单位
Department of Energy, Agile BioFoundry; Department of Biomass Science and Conversion Technology, Sandia National Laboratories; Advanced Biofuels and Bioproducts Process Development Unit, Lawrence Berkeley National Laboratory; Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Earth and Biological Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory; Energy and Environment Directorate, Pacific Northwest National Laboratory; QB3-Berkeley, University of California
杂志
Microbial Cell Factories（2020）
DOI
10.1186/s12934-020-1293-8
所属领域
代谢工程
关键词
DiterpeneGeranylgeranyl pyrophosphate synthaseMetabolic engineeringMevalonate pathwayMutant farnesyl pyrophosphate synthaseRhodotorula
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解决的核心问题

利用木质纤维素水解液在 Rhodosporidium toruloides 中生产非天然二萜 ent-kaurene，解决二萜前体 GGPP 供应不足的问题

研究策略

采用设计-构建-测试-学习（DBTL）循环，先表达 Gibberella fujikuroi 的 kaurene 合酶（GfKS），再筛选最佳 GGPP 合酶（包括天然和突变型），并使用强启动子 ANT 和 TEF1 平衡 KS 与 GGPPS 的表达，最后在 2 L 生物反应器中以玉米秸秆 DMR-EH 水解液进行放大培养

研究路线图

100%
研究问题：木质纤维素水解液生产 ent-kaurene，解决 GGPP 供应不足
策略：DBTL 循环，筛选最佳 GGPP 合酶与启动子
关键改造 1：表达 GfKS 环化 GGPP 生成 ent-kaurene
关键改造 2：突变型 GgFPS(F112A) 高效供应 GGPP
关键改造 3：ANT+TEF1 强启动子协同表达
结果：YPD10 中产量达 531 mg/L
结果：2 L 反应器中 1.44 g/L，玉米秸秆水解液
结论：R. toruloides 生产二萜的有效路线
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核心内容

本研究以圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）为宿主，通过设计-构建-测试-学习（DBTL）循环，实现了从木质纤维素水解液生产非天然二萜ent-kaurene。研究中首先表达 Gibberella fujikuroi 的kaurene合酶（GfKS），但单独表达时产量仅为15–20 mg/L。随后筛选多种GGPP合酶以改善前体供应，发现共表达鸡源突变型FPP合酶GgFPS(F112A)可使产量提高17倍至345 mg/L。进一步利用强启动子ANT和TEF1分别驱动GfKS与GgFPS(F112A)的协同表达，在YPD10培养基中最高产量达531 mg/L。在2 L生物反应器中以75%玉米秸秆DMR-EH水解液进行放大培养，ent-kaurene产量达1.44 g/L，OD600达到70，葡萄糖和木糖分别在161小时和207小时内完全消耗。研究首次证明R. toruloides能够高效生产非天然二萜，通过平衡KS与GGPPS表达可实现g/L级产量，为利用木质纤维素原料生产二萜类化合物提供了可行的技术路线。

创新点

['首次在 R. toruloides 中生产非天然二萜 ent-kaurene', '利用突变型 FPP 合酶（GgFPS(F112A)）高效产生 GGPP', '结合强启动子 ANT 和 TEF1 实现 KS 和 GGPPS 的协同表达', '在玉米秸秆水解液中实现 g/L 级 ent-kaurene 产量']

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Rhodosporidium toruloides IFO0880 甲羟戊酸（MVA）通路 / 二萜合成 GfKS Gibberella fujikuroi kaurene synthase (Q9UVY5) 催化 将 GGPP 直接环化为 ent-kaurene
Rhodosporidium toruloides IFO0880 异戊二烯代谢 / GGPP 合成 RTERG20(F91C) R. toruloides 突变 FPP 合酶 催化 F91C 突变使酶产生 GGPP 而非 FPP
Rhodosporidium toruloides IFO0880 异戊二烯代谢 / GGPP 合成 TCGGPPS(S239C,G295D) Taxus canadensis 突变 GGPP 合酶 催化 S239C 和 G295D 突变提高 GGPP 合酶活性
Rhodosporidium toruloides IFO0880 异戊二烯代谢 / GGPP 合成 GgFPS(F112A) Gallus gallus 突变 FPP 合酶 (P08836.2) 催化 F112A 突变使酶主要产生 GGPP，共表达效果最佳
Rhodosporidium toruloides IFO0880 异戊二烯代谢 / GGPP 合成 RtBTS1 R. toruloides 天然 GGPP 合酶 BTS1 催化 天然 GGPPS，过表达可提高 GGPP 供应

关键发现

  1. 单独表达 GfKS 时 ent-kaurene 产量仅 15-20 mg/L
  2. 共表达 GgFPS(F112A) 后产量提高 17 倍，达到 345 mg/L
  3. 将 P_ANT-GfKS 与 P_TEF1-GgFPS(F112A) 共转化后，在 YPD10 培养基中最高产量达 531 mg/L
  4. 在 2 L 生物反应器中使用 75% 玉米秸秆 DMR-EH 水解液，ent-kaurene 产量达 1.44 g/L，OD600 达 70，葡萄糖和木糖分别在 161 h 和 207 h 内完全消耗

研究结论

本研究证明了 R. toruloides 是生产非天然二萜的优良宿主，通过平衡 KS 和 GGPPS 表达可实现 g/L 级 ent-kaurene 产量，为利用木质纤维素原料生产二萜类化合物提供了路线图