In vivo creation of plasmid pCRT01 and its use for the construction of carotenoid-producing Paracoccus spp. strains that grow efficiently on industrial wastes
- 作者
- Anna Maj, Lukasz Dziewit, Lukasz Drewniak, Maciej Garstka, Tomasz Krucon, Katarzyna Piatkowska, Katarzyna Gieczewska, Jakub Czarnecki, Ewa Furmanczyk, Robert Lasek, Jadwiga Baj, Dariusz Bartosik
- 单位
- Department of Bacterial Genetics, Institute of Microbiology, Faculty of Biology, University of Warsaw; Department of Environmental Microbiology and Biotechnology, Institute of Microbiology, Faculty of Biology, University of Warsaw; Department of Metabolic Regulation, Institute of Biochemistry, Faculty of Biology, University of Warsaw; Department of Plant Anatomy and Cytology, Institute of Experimental Plant Biology and Biotechnology, Faculty of Biology, University of Warsaw; Bacterial Genome Plasticity, Department of Genomes and Genetics, Institut Pasteur; Department of Plant Protection from Pests, Research Institute of Horticulture
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2020）
- DOI
- 10.1186/s12934-020-01396-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用天然类胡萝卜素生产菌株如Paracoccus属，但其部分菌株难以遗传操作且生长差；而一些无色Paracoccus菌株生长快但缺乏类胡萝卜素合成能力。如何将类胡萝卜素合成能力导入这些生长快速的宿主，并利用低成本工业废弃物实现高效生产。
研究策略
从Paracoccus marcusii OS22中克隆crt基因簇（CRT cassette），通过体内非法重组构建携带该基因簇的质粒pCRT01，将其转入快速生长的无色菌株P. aminophilus和P. kondratievae中，获得产类胡萝卜素菌株，并利用工业废料（脱硫废水和糖蜜）开发低成本培养基。
核心内容
该研究从类胡萝卜素生产菌Paracoccus marcusii OS22中克隆了含crtWZYIBE六个基因的色素合成基因簇，通过体内非法重组自然构建了无需抗生素筛选即可稳定维持的穿梭质粒pCRT01，并将其转入生长快速但无色素合成能力的P. aminophilus和P. kondratievae中，成功获得产类胡萝卜素的工程菌株。pCRT01在无抗生素条件下经约120代稳定遗传，且同一基因簇在不同宿主中产生不同的色素谱：P. aminophilus CRT1主要产β-胡萝卜素，而P. kondratievae CRT2则合成虾青素、金盏花红素、角黄素等多种类胡萝卜素。研究还利用燃煤电厂脱硫废水和糖蜜开发了低成本培养基，在FGD/糖蜜培养基中P. aminophilus CRT1的类胡萝卜素浓度达127.09 ng mL⁻¹，效率为117.68 μg g⁻¹ d.w.；在LB培养基中其效率最高达452.5 μg g⁻¹ d.w.。该策略通过单质粒介导的基因簇转移和工业废料利用，为低成本微生物生产类胡萝卜素提供了可行途径，同时揭示了宿主背景对代谢途径产物的显著影响。
创新点
1. 利用体内非法重组自然构建了穿梭质粒pCRT01，无需抗生素筛选即可稳定维持；2. 同一CRT cassette在不同宿主中产生不同色素谱，展示了宿主背景对代谢途径的影响；3. 开发了基于燃煤电厂脱硫废水和糖蜜的低成本培养基，实现类胡萝卜素高效生产。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Paracoccus aminophilus JCM 7686R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE | Geranylgeranyl diphosphate synthase (CrtE) | 催化 | GGPP合酶，催化IPP/DMAPP延伸生成GGPP |
| Paracoccus aminophilus JCM 7686R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtB | Phytoene synthase (CrtB) | 催化 | 八氢番茄红素合酶 |
| Paracoccus aminophilus JCM 7686R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | Phytoene desaturase (CrtI) | 催化 | 八氢番茄红素脱氢酶 |
| Paracoccus aminophilus JCM 7686R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtY | Lycopene cyclase (CrtY) | 催化 | 番茄红素环化酶 |
| Paracoccus aminophilus JCM 7686R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtZ | β-carotene hydroxylase (CrtZ) | 催化 | β-胡萝卜素羟化酶 |
| Paracoccus aminophilus JCM 7686R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtW | β-carotene ketolase (CrtW) | 催化 | β-胡萝卜素酮化酶 |
| Paracoccus kondratievae NCIBM 13773R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE | Geranylgeranyl diphosphate synthase (CrtE) | 催化 | GGPP合酶 |
| Paracoccus kondratievae NCIBM 13773R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtB | Phytoene synthase (CrtB) | 催化 | 八氢番茄红素合酶 |
| Paracoccus kondratievae NCIBM 13773R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | Phytoene desaturase (CrtI) | 催化 | 八氢番茄红素脱氢酶 |
| Paracoccus kondratievae NCIBM 13773R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtY | Lycopene cyclase (CrtY) | 催化 | 番茄红素环化酶 |
| Paracoccus kondratievae NCIBM 13773R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtZ | β-carotene hydroxylase (CrtZ) | 催化 | β-胡萝卜素羟化酶 |
| Paracoccus kondratievae NCIBM 13773R | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtW | β-carotene ketolase (CrtW) | 催化 | β-胡萝卜素酮化酶 |
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtWZYIBE | CrtW, CrtZ, CrtY, CrtI, CrtB, CrtE | 催化 | 作为克隆和异源表达宿主，pABW1-crt在E. coli中产生浅橙色 |
| Paracoccus marcusii OS22 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtWZYIBE | CrtW, CrtZ, CrtY, CrtI, CrtB, CrtE | 催化 | 原始产类胡萝卜素菌株，提供crt基因簇 |
关键发现
- 构建的P. aminophilus CRT1主要产β-胡萝卜素，P. kondratievae CRT2产多种类胡萝卜素（虾青素、金盏花红素、角黄素等）
- pCRT01在无抗生素条件下经约120代稳定维持
- 在FGD/糖蜜培养基中，P. aminophilus CRT1的类胡萝卜素浓度达127.09 ng mL⁻¹，效率为117.68 μg g⁻¹ d.w.；P. kondratievae CRT2的浓度58.80 ng mL⁻¹，效率60.00 μg g⁻¹ d.w.
- 在LB培养基中，P. aminophilus CRT1效率最高达452.5 μg g⁻¹ d.w.，P. kondratievae CRT2为265.4 μg g⁻¹ d.w.
- 以糖蜜为碳源时，M9/糖蜜中还原糖消耗显著，P. kondratievae CRT2达79%
- crt基因簇包含crtWZYIBE六个基因，在crtI和crtB中插入转座子导致色素合成缺陷
- 在M9/甲醇中产量较低，P. aminophilus CRT1仅1.28 ng mL⁻¹，效率8.00 μg g⁻¹ d.w.。
研究结论
该研究展示了一种新策略：通过单个质粒介导的色素合成基因簇转移，构建类胡萝卜素生产菌株。利用不同宿主和低成本工业废料培养基，可提高微生物生产类胡萝卜素的成本效益。