Genome mining in Trichoderma viride J1-030: discovery and identification of novel sesquiterpene synthase and its products
- 作者
- Xiang Sun, You-Sheng Cai, Yujie Yuan, Guangkai Bian, Ziling Ye, Zixin Deng, Tiangang Liu
- 单位
- Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery, Ministry of Education and School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan, 430071, P. R. China
- 杂志
- Beilstein Journal of Organic Chemistry（2019）
- DOI
- 10.3762/bjoc.15.202
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从 Trichoderma viride J1-030 中发现并鉴定一个此前未被研究的新倍半萜合酶，并解析其催化产物的化学结构，填补该菌株倍半萜合酶研究的空白。
研究策略
采用基因组挖掘结合代谢工程策略，利用法尼基焦磷酸（FPP）过表达的酿酒酵母 YZL141 平台异源表达预测的萜类合酶基因 Tvi09626，同时进行体外酶活分析和体内产物富集，通过 GC-MS、NMR 对产物进行结构鉴定。
核心内容
本研究通过基因组挖掘与代谢工程相结合的策略，从绿色木霉Trichoderma viride J1-030中发现并鉴定了一个此前未被表征的新倍半萜合酶Tvi09626。研究者将预测的萜类合酶基因Tvi09626在法尼基焦磷酸过表达的酿酒酵母YZL141平台中异源表达，并辅以体外酶活分析，实现体内产物富集与体外功能验证；随后利用GC-MS和NMR对产物进行结构鉴定。结果表明，Tvi09626与近缘物种中预测蛋白的序列一致性为85%~90%，以FPP为唯一底物，依赖Mg2+催化，属于I类萜类合酶，含保守的DDxxD/E、NSE/DTE、RY及二聚化R基序。该酶催化生成一种新型brasilane型5/6双环倍半萜（C15H26O）及其C-11酯化衍生物（C17H28O2），经HPLC纯化分别获得23.1 mg和13.2 mg产物。该研究首次从T. viride中表征倍半萜合酶，并首次通过生物合成基因获得brasilane型倍半萜，证明基因组挖掘结合异源表达策略可高效发现稀有真菌中的未知萜类化合物，为萜类天然产物的发掘提供了可行途径。
创新点
首次从 T. viride 中鉴定并表征了一个倍半萜合酶 Tvi09626；首次通过生物合成基因获得brasilane型5/6双环倍半萜；证明基因组挖掘与异源表达组合策略可高效发现稀有真菌中的未知萜类。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae YZL141 | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径上游） | Tvi09626 | Tvi09626（倍半萜合酶） | 催化 | 异源表达平台，FPP过表达用于产物富集 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 体外蛋白表达 | Tvi09626 | Tvi09626（倍半萜合酶） | 催化 | 用于体外酶活验证和动力学分析 |
| Trichoderma viride J1-030 | 萜类（倍半萜）生物合成 | Tvi09626 | Tvi09626（倍半萜合酶） | 催化 | 来源菌株，基因组挖掘目标基因 |
关键发现
- Tvi09626 与 T. virens Gv29-8 和 T. reesei QM6a 中预测蛋白的序列一致性分别为89.66%和85.23%
- 该酶以 FPP 为唯一底物，依赖 Mg2+
- 其产物为一种新的5/6双环倍半萜（化合物1，C15H26O）及其 C-11 酯化衍生物（化合物2，C17H28O2），经 HPLC 纯化分别得到23.1 mg和13.2 mg
- 动力学参数：kcat=(15±0.3)×10^-2，Km=(0.44±0.11)×10^-6，kcat/Km=(35.32±0.57)×10^3
- 该酶为 I 类萜类合酶，含保守的 DDxxD/E、NSE/DTE、RY 和二聚体 R 基序。
研究结论
通过基因组挖掘和酿酒酵母代谢工程平台，成功从 T. viride J1-030 中鉴定并表征了第一个倍半萜合酶 Tvi09626，其产物为 brasilane 型5/6双环倍半萜，其中含一个不常见的偕二甲基季碳。该研究为从稀有真菌中发现新萜类化合物提供了有效途径，并首次经生物合成基因获得 brasilane 型倍半萜。