Functions of enzyme domains in 2-methylisoborneol biosynthesis and enzymatic synthesis of non-natural analogs
- 作者
- Binbin Gu, Lin-Fu Liang, Jeroen S. Dickschat
- 单位
- Kekule-Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, University of Bonn
- 杂志
- Beilstein Journal of Organic Chemistry（2023）
- DOI
- 10.3762/bjoc.19.104
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
研究2-甲基异冰片生物合成中2MIBs酶N端脯氨酸丰富结构域的功能，并探索利用底物类似物通过FPPS和2MIBs酶法合成非天然2-甲基异冰片类似物的可能性。
研究策略
比较全长2MIBs与截短变体（除去N端结构域）、单独A结构域、B结构域及A+B组合的酶活性和长期溶解度，解析N端结构域功能；合成多种DMAPP和IPP类似物，与FPPS和2MIBs进行体外反应，筛选能生成非天然产物的底物组合并进行制备级合成。
核心内容
该研究系统解析了2-甲基异冰片合酶（2MIBs）中N端脯氨酸丰富结构域（A结构域）的功能，并探索了利用底物类似物酶法合成非天然2-甲基异冰片类似物的可行性。通过比较全长2MIBs与其截短变体（去除N端结构域）、单独A结构域、单独B结构域及A+B组合的酶活性和长期溶解度，发现N端结构域具有双重调控功能：单独B结构域产量为全长酶的238±4%，A+B组合为137±6%，表明N端结构域在完整酶中起到“看门人”作用，降低催化活性；但4°C放置12小时后单独B结构域显著沉淀而全长2MIBs保持稳定，说明该结构域对蛋白长期稳定性至关重要。此外，研究合成了多种DMAPP和IPP类似物，与法尼基二磷酸合酶及2MIBs进行体外偶联反应，其中2-Me-GPP合成产率达71%，DA-3、DA-4和DA-5产率分别为87%、92%和90%。通过DA-4+IA-1和DA-5+IA-1组合成功制备了两种新的C12单萜类似物以及一种不可分离的混合物（比例8:3），证明2MIBs对略大于天然底物的类似物表现出底物灵活性。该工作揭示了酶结构域在催化与稳定性间的进化权衡，并为体外合成非天然C12单萜及开发新型萜类生物合成途径提供了策略参考。
创新点
首次揭示2MIBs的脯氨酸丰富N端结构域作为‘看门人’降低酶活性但提高蛋白长期稳定性的双重功能；利用DMAPP和IPP类似物组合成功制备两种新的C12单萜类似物和两种不可分离的混合物。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 2-甲基异冰片生物合成 | 2MIBs | 2-甲基异冰片合酶 | 催化 | 来自Streptomyces coelicolor，全长酶，催化2-Me-GPP环化生成2-甲基异冰片 |
| Escherichia coli | 2-甲基异冰片生物合成 | 2MIBs-A | 2MIBs N端脯氨酸丰富结构域（A结构域） | 调控 | 单独表达无催化活性，降低全长酶活性并提高长期溶解度 |
| Escherichia coli | 2-甲基异冰片生物合成 | 2MIBs-B | 2MIBs C端催化结构域（B结构域） | 催化 | 单独表达产量为全长酶的238±4%，但长期稳定性差 |
| Escherichia coli | 萜类生物合成前体供给 | FPPS | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 来自Streptomyces coelicolor，催化DMAPP类似物与IPP类似物缩合生成GPP类似物 |
| Escherichia coli | 2-甲基异冰片生物合成旁路 | humMT | GPP甲基转移酶humMT | 催化 | 来自Micromonospora humi，在背景方案中甲基化DMAPP生成2-Me-IPP |
关键发现
- 全长2MIBs的产物产量归一化为100%，单独B结构域产量为238±4%，A+B组合产量为137±6%，A结构域单独无活性
- 4°C放置12小时后，B结构域显著沉淀而全长2MIBs不沉淀。通过DA-4+IA-1和DA-5+IA-1组合成功合成化合物2和3，以及4和5的不可分离混合物（比例8:3）。2-Me-GPP合成产率71%，DA-3、DA-4、DA-5的合成产率分别为87%、92%、90%。
研究结论
N端结构域通过降低酶活并提高长期稳定性调控2MIBs的功能；2MIBs对略大于天然底物2-Me-GPP的类似物表现出底物灵活性，可用于合成非天然C12单萜类似物，可能为进化出新的C12单萜生物合成途径提供参考。