Engineering Escherichia coli for increased Und-P availability leads to material improvements in glycan expression technology
- 作者
- Emily J. Kay, Manoj K. Dooda, Joseph C. Bryant, Amanda J. Reid, Brendan W. Wren, Jerry M. Troutman, Matthew A. Jorgenson
- 单位
- Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London WC1E 7HT, UK; Department of Biological Sciences, University of North Carolina at Charlotte, Charlotte, NC 28223, USA; Department of Microbiology and Immunology, University of Arkansas for Medical Sciences, 4301 West Markham St. / Biomed I, Room 511 / Little Rock, Little Rock, AR 72205, USA; Nanoscale Science Program, University of North Carolina at Charlotte, Charlotte, NC 28223, USA; Department of Chemistry, University of North Carolina at Charlotte, Charlotte, NC 28223, USA
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2024）
- DOI
- 10.1186/s12934-024-02339-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
细菌表面聚糖的合成依赖脂质载体十一异戊烯基磷酸（Und-P），但通常 Und-P 的可用量有限，且增加 Und-P 对聚糖表达的影响尚不清楚。
研究策略
通过敲除大肠杆菌中所有非必需的磷酸糖基转移酶（PGT/GT）构建 Und-P 途径最小化菌株（ΔPGT/GT），并利用质粒过表达 Und-P 合酶基因 uppS 以提高 Und-P 合成速率，从而增加 Und-P 的可用性。随后检测内源聚糖（ECA）和重组肺炎链球菌4型荚膜多糖（SP4）的表达水平。
核心内容
本研究通过敲除大肠杆菌中所有非必需的磷酸糖基转移酶（PGT/GT）构建了Und-P途径最小化菌株（ΔPGT/GT），并利用质粒过表达十一异戊烯基焦磷酸合酶基因uppS，系统考察了脂质载体Und-P可用性对聚糖表达的影响。结果显示，ΔPGT/GT菌株的游离Und-P分子数约为301,000/细胞，较野生型（123,000/细胞）增加145%；在此基础上过表达uppS可进一步提高至387,000/细胞，增加215%。在功能验证中，过表达uppS使表面肠杆菌共同抗原（ECA）表达增加75%；在重组肺炎链球菌4型荚膜多糖（SP4）表达体系中，工程菌株经25小时诱导后产量较野生型对照增加1687%，ELISA定量显示5小时时产量达43.74 ng/μL，而对照组仅为1.03 ng/μL。研究首次证明大肠杆菌可被工程化以维持更高水平Und-P，且增加Und-P可用性同时提升内源和重组聚糖的表达，表明Und-P是糖工程系统的关键瓶颈，该策略有望显著改善聚糖疫苗及诊断治疗产品的产量。
创新点
首次证明大肠杆菌可以被工程化以维持更高的 Und-P 水平；证明增加 Und-P 可用性可同时提高内源和重组聚糖的表达；提出了 Und-P 可用性应作为糖工程系统的首要考虑因素。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 十一异戊烯基磷酸（Und-P）生物合成 | uppS | UppS（十一异戊烯基焦磷酸合酶） | 催化 | 过表达 uppS 以增加 Und-P 合成速率，提高细胞内 Und-P 池 |
| Escherichia coli | 肠杆菌共同抗原（ECA）和 O-抗原生物合成 | wecA | WecA（磷酸糖基转移酶） | 催化 | 敲除 wecA 以减少 Und-P 竞争；在 ECA 合成中起始第一个糖基转移 |
| Escherichia coli | colanic acid 荚膜多糖生物合成 | wcaJ | WcaJ（磷酸糖基转移酶） | 催化 | 敲除 wcaJ 以减少 Und-P 竞争 |
| Escherichia coli | O-抗原葡萄糖修饰 | gtrB | GtrB（磷酸糖基转移酶） | 催化 | 敲除 gtrB 以减少 Und-P 竞争 |
| Escherichia coli | 脂质 A 氨基阿拉伯糖修饰 | arnC | ArnC（磷酸糖基转移酶） | 催化 | 敲除 arnC 以减少 Und-P 竞争 |
| Escherichia coli | 肠杆菌共同抗原（ECA）生物合成 | wecB | WecB（UDP-N-乙酰葡糖胺 2-表异构酶） | 催化 | 敲除 wecB 以阻止 ECA 中间体产生，避免 Und-P 被螯合，但不影响 Und-P 水平 |
| Escherichia coli (CLM37, Falcon 等) | UDP-N-乙酰半乳糖胺（UDP-GalNAc）合成 | gne | Gne（UDP-GlcNAc/Glc 4-表异构酶） | 催化 | 来自空肠弯曲杆菌，过表达增加 GalNAc 可用性，促进 SP4 合成 |
| Escherichia coli (Sparrowhawk) | 肺炎链球菌4型荚膜多糖链长调控 | wzD-wzE | WzD/WzE（链长调节蛋白） | 调控 | 重新引入 wzDE 以调控 SP4 多糖链长，增强表达 |
| Escherichia coli | Und-PP 去磷酸化 | bacA | BacA（十一异戊烯基焦磷酸磷酸酶） | 催化 | 讨论中提及，过表达 bacA 未能提高游离 Und-P 水平，因此本文采用 uppS 过表达策略 |
| Escherichia coli | 蛋白糖基化连接技术（PGCT） | pglB | PglB（寡糖转移酶） | 催化 | 来自空肠弯曲杆菌，催化寡糖转移到载体蛋白，是 PGCT 的关键酶，文中作为背景提及 |
关键发现
- ΔPGT/GT 细胞的游离 Und-P 分子数约为 301,000/细胞，比野生型（123,000/细胞）增加 145%；ΔPGT/GT/puppS 细胞可诱导维持约 387,000/细胞，比野生型增加 215%。过表达 uppS 使 wbbL::IS5 菌株的表面 ECA 表达增加 75%。在重组 SP4 表达中，CLM37/pB4/pgne/vector 细胞经 5 h 和 25 h 诱导后，SP4 产量比 W3110/pB4/vector 增加 522% 和 1687%；进一步过表达 uppS 的 CLM37/pB4/pgne/puppS 在 5 h 和 25 h 分别再增加 568% 和 40%。ELISA 定量显示，5 h 时 ΔPGT/GT/pB4/pgne/puppS 的 SP4 产量为
- 74 ng/μL，而 W3110/pB4/vector 仅
- 03 ng/μL。摘要指出 ΔPGT/GT/puppS 细胞可诱导表达比传统大肠杆菌细胞多 7 倍的肺炎链球菌 4 型荚膜多糖。
研究结论
大肠杆菌可通过降低 Und-P 消耗和增加 Und-P 合成来维持更高的 Und-P 水平，从而显著提高内源及外源 Und-P 依赖性聚糖的表达。Und-P 可用性是糖工程系统中的一个关键瓶颈，提高 Und-P 有望改善聚糖疫苗、诊断和治疗产品的产量。