Evolutionary and reverse engineering in Saccharomyces cerevisiae reveals a Pdr1p mutation-dependent mechanism for 2-phenylethanol tolerance
- 作者
- Huili Xia, Yue Kang, Zilin Ma, Cuiyu Hu, Qiao Yang, Xiaoling Zhang, Shihui Yang, Jun Dai, Xiong Chen
- 单位
- Key Laboratory of Fermentation Engineering (Ministry of Education), Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation (Ministry of Education & Hubei Province), National"111" Center for Cellular Regulation and Molecular Pharmaceutics, College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan, Hubei 430068, People's Republic of China; ABI Group, College of Marine Science and Technology, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, Zhejiang, China; State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, Hubei, China
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2022）
- DOI
- 10.1186/s12934-022-01996-x
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
酿酒酵母对2-苯乙醇（2-PE）的耐受性机制尚不清楚，限制了通过理性设计提高其耐受性和产量的能力。本文旨在通过适应性实验室进化获得耐受菌株并解析其遗传基础。
研究策略
利用微生物微滴培养系统（MMC）对酿酒酵母CEN.PK113-7D进行适应性实验室进化（ALE），逐步提高2-PE浓度获得耐受菌株19-2；通过全基因组测序鉴定突变，利用CRISPR-Cas9反向工程构建点突变菌株，验证Pdr1p C862R突变的功能；通过脂肪酸分析、麦角固醇测定、ROS检测和实时定量PCR解析耐受机制。
核心内容
本研究针对酿酒酵母2-苯乙醇耐受性机制不明的问题，利用微生物微滴培养系统对CEN.PK113-7D进行适应性实验室进化，逐步提高2-PE浓度获得耐受菌株19-2。该菌株在3.5 g/L 2-PE胁迫下最大OD600和生长速率较亲本分别提高86%和22%，膜破裂分数降低55%。全基因组测序鉴定出349个突变，其中PDR1基因C862R错义突变被CRISPR-Cas9反向工程证实为耐受性关键。构建的PDR1_862菌株在3.5 g/L 2-PE下最大OD600比参考菌株高67%，UFA/SFA比率提高42%，麦角固醇含量在稳定期提高72%，胞内ROS浓度降低81%，同时2-PE产量提高11%至3.34 g/L。机制解析表明Pdr1p C862R突变通过调节脂肪酸比例、麦角固醇含量和ROS水平协同增强膜稳定性和细胞耐受性。该研究首次揭示Pdr1p点突变在2-PE耐受中的核心作用，为理性设计高耐受高产酵母菌株提供了明确靶点和分子机制基础。
创新点
首次揭示Pdr1p C862R突变是2-苯乙醇耐受的关键，通过调节脂肪酸比例、麦角固醇含量和ROS水平实现耐受；结合ALE、全基因组测序和反向工程系统解析耐受机制；发现Pdr1p突变不仅提高耐受性还增加2-PE产量。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 2-苯乙醇耐受 | PDR1 | Pdr1p | 调控 | C862R突变（GOF）提高2-PE耐受性，位于中心调控结构域 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 2-苯乙醇耐受 | PDR1 | Pdr1p | 调控 | 反向工程验证C862R突变功能 |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞壁完整性信号 | PKH1 | Pkh1p | 调控 | 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，突变未提高2-PE耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 环境胁迫适应 | PAU20 | Pau20p | 调控 | PAU家族成员，突变未提高2-PE耐受性，但影响脂肪酸组成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 碳代谢/2-PE合成 | PDC1 | Pdc1p | 催化 | 丙酮酸脱羧酶，突变与碳代谢相关 |
| Saccharomyces cerevisiae | 麦角固醇生物合成 | ERG11 | Erg11p | 催化 | 羊毛固醇14-α-脱甲基酶，Pdr1p靶标，受Pdr1p突变上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 多药耐药/ABC转运 | PDR5 | Pdr5p | 转运 | ABC转运蛋白，Pdr1p靶标，参与药物外排 |
| Saccharomyces cerevisiae | 多药耐药/ABC转运 | PDR10 | Pdr10p | 转运 | ABC转运蛋白，Pdr1p靶标 |
| Saccharomyces cerevisiae | 麦角固醇摄取/ABC转运 | PDR11 | Pdr11p | 转运 | ABC转运蛋白，参与麦角固醇摄取，Pdr1p靶标 |
| Saccharomyces cerevisiae | 麦角固醇摄取 | AUS1 | Aus1p | 转运 | ABC转运蛋白，参与麦角固醇摄取，Pdr1p靶标 |
| Saccharomyces cerevisiae | 麦角固醇调控 | UPC2 | Upc2p | 调控 | 转录因子，调控麦角固醇合成基因，Pdr1p互作蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae | ROS清除 | CTT1 | Ctt1p | 催化 | 过氧化氢酶，受Pdr1p突变上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | ROS清除 | GSH2 | Gsh2p | 催化 | 谷胱甘肽合成酶，受Pdr1p突变上调 |
关键发现
- 进化菌株19-2在3.5 g/L 2-PE胁迫下最大OD600和生长速率较亲本A2-5分别提高86%和22%，膜破裂分数降低55%。全基因组测序共检测到349个突变（244个indel和105个SNP），其中PDR1基因发生C862R错义突变。反向工程证实Pdr1p C862R突变是提高2-PE耐受性的主要原因：PDR1_862菌株在3.5 g/L 2-PE下最大OD600比参考菌株CEN.PK113-5D高67%
- UFA/SFA比率提高42%，细胞膜破裂分数降低38%
- 麦角固醇含量在中期对数、后期对数和稳定期分别提高101%、94%和72%
- 细胞内ROS浓度降低81%（正文数据）。此外，PDR1_862菌株的2-PE产量比参考菌株提高11%，最高产量达3.34 g/L。
研究结论
本研究证明ALE是提高酵母2-PE耐受性的有效手段，并揭示Pdr1p C862R突变通过调节脂肪酸比例、麦角固醇含量和ROS水平显著增强2-PE耐受性，同时提高2-PE产量，为设计更稳健的天然2-PE合成酵母菌株提供了新见解。