Production of \(\alpha\) -ketoisovalerate with whey powder by systemic metabolic engineering of Klebsiella oxytoca
- 作者
- Weikang Sun, Shuo Wang, Xiaoxu Tan, Leilei Guo, Wei Liu, Wenjia Tian, Hui Zhang, Tianyi Jiang, Wensi Meng, Yidong Liu, Zhaoqi Kang, Chuanjuan Lu, Chao Gao, Ping Xu, Cuiqing Ma
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2024）
- DOI
- 10.1186/s12934-024-02545-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
以乳清粉为低成本底物，通过系统代谢工程改造Klebsiella oxytoca，实现α-酮异戊酸的高效发酵生产
研究策略
以L-缬氨酸生产菌株K. oxytoca VKO-9为出发菌株，通过失活亮氨酸脱氢酶（LeuDH）和支链α-酮酸脱氢酶（BkdAA）阻断α-酮异戊酸的消耗和降解，同时过表达α-乙酰乳酸合酶（BudB、AlsS）和偏好NADH的突变型乙酰羟酸异构还原酶（AHAIR^M），增强α-酮异戊酸的前体供应，最终获得整合基因组、无质粒依赖的工程菌株KIV-7
核心内容
研究以产L-缬氨酸的Klebsiella oxytoca VKO-9为出发菌株，通过系统代谢工程实现α-酮异戊酸的高效发酵生产。策略上，失活亮氨酸脱氢酶（LeuDH）和支链α-酮酸脱氢酶（BkdAA）阻断目标产物的消耗与降解，同时过表达α-乙酰乳酸合酶（BudB、AlsS）及偏好NADH的突变型乙酰羟酸异构还原酶（AHAIR^M）以强化前体供应，最终获得所有关键基因整合于基因组、无需质粒和诱导剂的工程菌株KIV-7。该菌株利用乳糖产α-酮异戊酸37.3 g/L（产率0.393 g/g），利用乳清粉时产量达40.7 g/L（产率0.418 g/g乳糖），葡萄糖分批发酵产量为24.8 g/L（产率0.413 g/g）。相较于大肠杆菌W1262利用乳清粉仅产3.22 g/L，产量提升12.6倍。逐步改造显示，失活leuDH后产量8.09 g/L，过表达budB后9.77 g/L，敲除bkdAA后12.7 g/L，表达AHAIR^M后18.8 g/L，最终过表达alsS达到24.8 g/L。该研究首次在K. oxytoca中系统构建α-酮异戊酸生产途径，实现了低成本废弃物乳清粉的资源化利用，所得菌株可作为α-酮异戊酸衍生物生产的通用底盘。
创新点
首次在Klebsiella oxytoca中系统改造生产α-酮异戊酸；利用乳清粉这一低成本废弃物作为原料；所有关键基因整合于基因组并组成型表达，无需质粒和诱导剂，提高了发酵稳定性
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella oxytoca | α-酮异戊酸生物合成 | leuDH | leucine dehydrogenase (LeuDH) | 催化 | 失活以阻断α-酮异戊酸还原胺化为L-缬氨酸，使α-酮异戊酸积累 |
| Klebsiella oxytoca | α-酮异戊酸降解途径 | bkdAA | branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex α-subunit | 催化 | 编码BCKDH复合物α亚基，失活以防止α-酮异戊酸氧化脱羧 |
| Klebsiella oxytoca | 丙酮酸代谢 | budB | α-acetolactate synthase (BudB) | 催化 | 内源ALS，在pox位点插入第二个拷贝以增强丙酮酸缩合 |
| Klebsiella oxytoca | 丙酮酸代谢 | alsS | α-acetolactate synthase (AlsS) from Bacillus subtilis | 催化 | 在frdA位点过表达，显著提高α-乙酰乳酸合成 |
| Klebsiella oxytoca | α-酮异戊酸生物合成 | ilvC^M | mutant acetohydroxyacid isomeroreductase (AHAIR^M) | 催化 | 突变型偏好NADH，增强表达以消耗过剩NADH |
| Klebsiella oxytoca | α-酮异戊酸生物合成 | ilvBN | acetohydroxyacid synthase IlvBN from E. coli | 催化 | 在KIV-6中尝试过表达，但效果不如alsS |
| Klebsiella oxytoca | 丙酮酸代谢 | pox | pyruvate oxidase | 催化 | 替换为budB以消除其催化丙酮酸生成乙酸，减少副产物 |
| Klebsiella oxytoca | 三羧酸循环/呼吸链 | frdA | fumarate reductase α-subunit | 催化 | 失活或替换以减少琥珀酸生成 |
关键发现
- 最终菌株K. oxytoca KIV-7利用乳糖产α-酮异戊酸37.3 g/L（产率0.393 g/g）
- 利用乳清粉产α-酮异戊酸40.7 g/L，产率0.418 g/g乳糖
- 以葡萄糖为底物分批发酵时产量24.8 g/L，产率0.413 g/g。与大肠杆菌W1262利用乳清粉仅产3.22 g/L相比，产量提高12.6倍。关键基因敲除和过表达逐步提高了产量：失活leuDH后产量8.09 g/L，过表达budB后9.77 g/L，再敲除bkdAA后12.7 g/L，过表达AHAIR^M后18.8 g/L，最终过表达alsS后达到24.8 g/L。
研究结论
通过系统代谢工程改造K. oxytoca，成功获得α-酮异戊酸高产菌株KIV-7，能够利用乳清粉高效生产α-酮异戊酸，实现废弃物资源化；该菌株可作为生产α-酮异戊酸衍生物的底盘菌株。