Improved production of Taxol® precursors in S. cerevisiae using combinatorial in silico design and metabolic engineering
- 作者
- Koray Malci, Rodrigo Santibáñez, Nestor Jonguitud-Borrego, Jorge H. Santoyo-Garcia, Eduard J. Kerkhoven, Leonardo Rios-Solis
- 单位
- Institute for Bioengineering, School of Engineering, University of Edinburgh; Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh; Department of Pediatrics, University of California, San Diego; Department of Life Sciences, Chalmers University of Technology; SciLifeLab, Chalmers University of Technology; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark; School of Natural and Environmental Sciences, Molecular Biology and Biotechnology Division, Newcastle University; Department of Biochemical Engineering, The Advanced Centre for Biochemical Engineering, University College London; Department of Bioengineering, Imperial College London
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2023）
- DOI
- 10.1186/s12934-023-02251-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用计算机辅助设计预测并验证能够提高酿酒酵母中Taxol®早期前体（尤其是紫杉二烯）产量的基因改造靶点，以突破现有菌株的产量瓶颈。
研究策略
结合三种约束性重建分析（COBRA）算法（OptKnock、OptGene、OptForce）与酵母基因组规模模型（Yeast 8.5.0），在不同碳源条件下预测基因敲除或过表达靶点；通过ACtive CRISPR工具进行基因组编辑，构建单基因和多基因修饰菌株，先后在深孔板和BioLector微量生物反应器中进行高通量筛选，最终在实验室规模生物反应器中验证最佳菌株。
核心内容
本研究将多种计算机辅助设计算法与湿实验筛选相结合，用于系统改造酿酒酵母以提高Taxol®早期前体紫杉二烯的产量。作者整合OptKnock、OptGene和OptForce三种约束性重建分析算法与酵母基因组规模模型，在不同碳源条件下预测了17个候选基因改造靶点（含9个敲除和8个过表达），并通过ACtive CRISPR工具逐一构建单基因和多基因修饰菌株，经深孔板、BioLector微量生物反应器及实验室规模反应器逐级筛选验证。最终鉴定出最佳菌株KM32，即同时过表达ILV2、TRR1、ADE13和ECM31四个看似无关基因的菌株。在BioLector中以半乳糖为碳源的完全合成培养基中，KM32的紫杉二烯产量达到215 mg/L，较亲本提高50%；同时T5α-ol产量达43.65 mg/L，T5αAc达26.2 mg/L，均为酿酒酵母中迄今报道的最高值。该工作展示了组合多种in silico算法可有效识别非直觉的协同改造靶点，为高价值萜类化合物的酵母细胞工厂构建提供了可借鉴的系统化策略。
创新点
首次将多种in silico设计算法（OptKnock、OptGene、OptForce）组合用于Taxol®前体生产菌株的系统改造；发现并验证了四个看似无关的基因（ILV2、TRR1、ADE13、ECM31）联合过表达能显著提高紫杉二烯产量；采用高通量BioLector平台实现溶氧充分供应，使含氧产物T5α-ol和T5αAc的产量大幅提升；报道了迄今为止酿酒酵母中最高的紫杉二烯、T5α-ol和T5αAc产量。
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸通路 / Taxol生物合成通路 | ILV2 | 乙酰乳酸合酶 (acetolactate synthase) | 催化 | 过表达，参与支链氨基酸生物合成，增加乙酰-CoA前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫氧还蛋白系统 | TRR1 | 硫氧还蛋白还原酶 (thioredoxin reductase) | 催化 | 过表达，保护细胞免受氧化应激 |
| Saccharomyces cerevisiae | 嘌呤从头合成途径 | ADE13 | 腺苷酸琥珀酸裂解酶 (adenylosuccinate lyase) | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 泛酸生物合成途径 | ECM31 | 酮泛解酸羟甲基转移酶 (ketopantoate hydroxymethyltransferase) | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 磷脂代谢 | DPP1 | 镁离子不依赖性磷脂酸磷酸酶 (Mg2+-independent phosphatidate phosphatase) | 催化 | 敲除，减少FPP/GGPP向法尼醇的转化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂肪酸生物合成 | OAR1 | NADPH依赖的3-氧酰基-ACP还原酶 (3-oxoacyl-ACP reductase) | 催化 | 敲除 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醛酸循环 | MDH3 | 过氧化物酶体苹果酸脱氢酶 (peroxisomal malate dehydrogenase) | 催化 | 敲除 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醛酸循环 / 线粒体乙酰-CoA代谢 | ACH1 | 乙酰-CoA水解酶 (acetyl-CoA hydrolase) | 催化 | 敲除 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醛酸循环 | MLS1 | 苹果酸合酶 (malate synthase) | 催化 | 敲除 |
| Saccharomyces cerevisiae | 孢子壁形成 | DIT1 | 孢子壁二酪氨酸层合成酶 (spore wall dityrosine layer biosynthesis protein) | 催化 | 敲除 |
| Saccharomyces cerevisiae | 磷脂代谢 | LPP1 | 脂质磷酸磷酸酶 (lipid phosphate phosphatase) | 催化 | 敲除 |
| Saccharomyces cerevisiae | 鞘脂代谢 | ISC1 | 肌醇磷酸鞘脂磷脂酶C (inositol phosphosphingolipid phospholipase C) | 催化 | 敲除 |
| Saccharomyces cerevisiae | 孢子壁组装 / 多药转运 | DTR1 | MFS超家族转运蛋白 (major facilitator superfamily transporter) | 转运 | 敲除，参与孢子壁成熟，可能影响GGPP浓度 |
| Saccharomyces cerevisiae | 嘌呤从头合成途径 | ADE4 | 酰胺磷酸核糖基转移酶 (amidophosphoribosyltransferase) | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 嘌呤从头合成途径 | ADE5,7 | 双功能酶 (phosphoribosylamine-glycine ligase / phosphoribosylformylglycinamidine cyclo-ligase) | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 泛酸生物合成途径 | CAB1 | 泛酸激酶 (pantothenate kinase) | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 多胺生物合成途径 | SPE2 | S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶 (S-adenosylmethionine decarboxylase) | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 半乳糖调控 | GAL80 | GAL80转录抑制剂 | 调控 | 敲除以允许葡萄糖条件下激活半乳糖诱导型启动子 |
| Saccharomyces cerevisiae | Taxol生物合成通路 | TASY | 紫杉二烯合酶 (taxadiene synthase) | 催化 | 异源表达，将GGPP转化为紫杉二烯 |
| Saccharomyces cerevisiae | Taxol生物合成通路 | T5αOH | 紫杉二烯-5α-羟化酶 (taxadiene-5α-hydroxylase) | 催化 | 异源表达，催化紫杉二烯羟化 |
| Saccharomyces cerevisiae | Taxol生物合成通路 | TAT | 紫杉二烯-5α-醇-O-乙酰转移酶 (taxadiene-5α-ol O-acetyltransferase) | 催化 | 异源表达，催化乙酰化生成T5αAc |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞色素P450系统 | CPR | 细胞色素P450还原酶 (cytochrome P450 reductase) | 催化 | 异源表达，为T5αOH提供电子 |
关键发现
- 通过筛选17个基因组修饰（9个基因敲除和8个基因过表达），确定了最佳菌株KM32（过表达ILV2、TRR1、ADE13和ECM31）。在BioLector微量生物反应器中，KM32在完全合成培养基（CSM）中以半乳糖为碳源时，紫杉二烯产量达到215 mg/L，较亲本菌株提高50%
- T5α-ol产量达43.65 mg/L，T5αAc产量达26.2 mg/L，均为酿酒酵母中迄今报道的最高值。此外，单基因修饰在深孔板筛选中可使紫杉二烯产量提高15%~40%
- 在BioLector中，KM33（KM32基础上敲除MDH3）的T5α-ol产量达到23 mg/L以上，约为深孔板最高值的3倍
- 生物反应器放大实验中，KM32的性能得到进一步验证。
研究结论
本研究证明了计算设计和系统整合策略在构建高效酵母细胞工厂方面的有效性。通过组合多种in silico算法和湿实验筛选，成功鉴定出ILV2、TRR1、ADE13和ECM31四个基因的过表达可协同增强GGPP通量，使Taxol®早期前体产量大幅提升，达到目前酿酒酵母中的最高水平，为高价值萜类化合物的工业化生产提供了潜在方案。