Discovery and biosynthesis of bacterial drimane-type sesquiterpenoids from Streptomyces clavuligerus
- 作者
- Dongxu Zhang, Wenyu Du, Xingming Pan, Xiaoxu Lin, Fang-Ru Li, Qingling Wang, Qian Yang, Hui-Min Xu, Liao-Bin Dong
- 单位
- State Key Laboratory of Natural Medicines, School of Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; The Public Laboratory Platform, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China
- 杂志
- Beilstein J. Org. Chem.（2024）
- DOI
- 10.3762/bjoc.20.73
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
首次从细菌（Streptomyces clavuligerus）中发现drimane型倍半萜天然产物，并阐明其生物合成途径，特别是负责A环氧化的P450酶及其底物选择性。
研究策略
通过基因组挖掘鉴定cav生物合成基因簇，结合异源表达、基因敲除、共表达及底物饲喂实验，研究DMS、Nudix水解酶和P450酶的功能，并通过NMR解析产物结构。
核心内容
该研究首次从细菌Streptomyces clavuligerus中发现并鉴定了三个新的drimane型倍半萜天然产物（3β-羟基drimenol、2α-羟基drimenol和3-酮基drimenol），并阐明了其生物合成途径。通过基因组挖掘，研究者鉴定出负责drimenol生物合成的cav基因簇，包含II类二磷酸drimenyl合酶CavC、Nudix水解酶CavB及三个P450酶。异源表达实验表明，将cav基因簇导入S. lividans和S. avermitilis可分别产生不同产物，7.5 L发酵获得2（14 mg）和3（5 mg）。基因敲除和共表达实验证实P450酶CavA能够区域选择性羟化drimenol的C-2和C-3位，是首个作用于DMT A环的天然P450。底物饲喂实验进一步拓展了CavA的底物谱，其可羟化albicanol和drim-8-ene-11-ol，其中产物9与diaporol E平面结构相同但C7羟基构型相反。该研究首次报道了细菌来源的drimane型倍半萜，CavA的区域选择性底物识别能力为drimane类化合物的化学酶法合成提供了新的生物催化元件。
创新点
['首次从细菌中分离鉴定天然drimane型倍半萜（3β-羟基drimenol、2α-羟基drimenol、3-酮基drimenol）', '发现并鉴定负责drimenol生物合成的cav基因簇，包括一种II类二磷酸drimenyl合酶（CavC）和Nudix水解酶（CavB）', '发现P450酶CavA能羟基化drimenol的C-2和C-3位（A环），是首个作用于DMT A环的天然P450', '通过底物饲喂实验拓展了CavA的底物谱，可接受albicanol和drim-8-ene-11-ol并进行区域选择性羟化']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces clavuligerus | drimane型倍半萜生物合成 | cavC | CavC (II类二磷酸drimenyl合酶) | 催化 | 催化FPP环化生成drimenyl二磷酸，含有保守DxDD motif，与SsDMS有50%序列相似性 |
| Streptomyces clavuligerus | drimane型倍半萜生物合成 | cavB | CavB（Nudix水解酶） | 催化 | 水解drimenyl二磷酸生成drimenol |
| Streptomyces clavuligerus | drimane型倍半萜生物合成 | cavA | CavA（P450） | 催化 | 羟基化drimenol的C-2和C-3位（A环），也能羟化albicanol和drim-8-ene-11-ol |
| Streptomyces clavuligerus | drimane型倍半萜生物合成 | cavE | CavE（P450） | 催化 | 预测为P450，但在天然或异源表达系统中未表现出功能 |
| Streptomyces clavuligerus | drimane型倍半萜生物合成 | cavG | CavG（P450） | 催化 | 预测为P450，但在天然或异源表达系统中未表现出功能 |
| Streptomyces clavuligerus | drimane型倍半萜生物合成 | cavF | CavF（I类萜环化酶） | 催化 | 推测参与萜类环化，具体功能未表征 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达drimenol合成 | cavC | CavC (II类二磷酸drimenyl合酶) | 催化 | 在截短的FPP过表达系统中表达，成功合成drimenol，验证其DMS功能 |
| Streptomyces avermitilis SUKA22 | drimane型倍半萜生物合成 | cavA | CavA（P450） | 催化 | 与cavB和cavC共表达（DL10089）产生2和3；cavA缺失突变株DL10086不产2或3 |
| Streptomyces lividans TK64 | drimane型倍半萜生物合成 | cavBGC | 完整cav基因簇 | 催化 | 异源表达整个cav簇仅产生化合物2（3β-羟基drimenol） |
关键发现
- 从S. clavuligerus中分离得到3个新的细菌DMTs：3β-羟基drimenol (2)、2α-羟基drimenol (3)和3-酮基drimenol (4)。基因组挖掘鉴定出cav BGC，包含CavC（与SsDMS有50%序列相似性，含保守DxDD motif）、CavB（Nudix水解酶）、CavF（I类萜环化酶）及三个P450（CavA、CavE、CavG）。异源表达cav BGC于S. lividans TK64仅产2，于S. avermitilis SUKA22产2和3
- 5 L发酵获得2（14 mg）和3（5 mg）。敲除cavA后菌株DL10086不再产生2或3
- 共表达cavC、cavB和cavA的DL10089可产2和3，证实CavA羟化C-2和C-3位。CavA底物谱显示能羟化albicanol (5)生成7（C-3位羟化），羟化drim-8-ene-11-ol (6)生成8（C-3位）和9（C-7位）
- 其中9与diaporol E平面结构相同但C7羟基构型相反，13C NMR化学位移差异ΔδC=3.3。
研究结论
本研究首次报道了细菌来源的天然DMTs，并阐明了其生物合成途径。CavA是第一个能氧化DMT A环的天然P450，具有区域选择性底物识别能力，为DMTs及drimanyl类化合物的化学酶法合成提供了新的生物催化元件。