A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products
- 作者
- Katherine M. Murphy, Siwon Chung, Shruti Fogla, Hana B. Minsky, Karen Yong Zhu, Philipp Zerbe
- 单位
- Department of Plant Biology, University of California Davis
- 杂志
- Journal of Visualized Experiments（2019）
- DOI
- 10.3791/59992
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
二萜类天然产物结构复杂且天然来源有限，难以高效获得足够纯度和产量的化合物，需要一种可定制、易操作且成本低廉的酶法生产与纯化方法。
研究策略
利用大肠杆菌（Escherichia coli）和本氏烟（Nicotiana benthamiana）作为底盘，通过共表达二萜合酶（ZmAN2、ZmKSL4）、细胞色素P450单加氧酶（CYP71Z18）及P450还原酶（ZmCPR2），模块化组合生成不同二萜骨架；采用分液漏斗萃取、硅胶柱层析和半制备HPLC纯化目标产物。
核心内容
本研究建立了一套可定制、低成本且无需昂贵设备的酶法生产与纯化二萜类天然产物的通用方案。作者以玉米dolabralexin途径为模型，在大肠杆菌中通过MEP途径相关基因（dxs、dxr、idi）强化前体供应，并共表达GGPPS、二萜合酶ZmAN2与ZmKSL4、细胞色素P450单加氧酶CYP71Z18及其还原酶ZmCPR2，模块化组合生成不同氧化程度的二萜骨架；同时将该体系移植至本氏烟中进行瞬时共表达验证。在大肠杆菌中，dolabradiene产量达1.2±0.25 mg/L，epoxydolabrene为0.65±0.2 mg/L，epoxydolabranol达11.4±1.1 mg/L；在本氏烟中每克干叶片可提取dolabradiene 2.4±0.5 mg和15,16-epoxydolabrene 0.9±0.3 mg。产物经分液漏斗萃取、硅胶柱层析和半制备HPLC可有效分离纯化。该方案兼具微生物和植物双宿主兼容性，所得产物的数量与纯度可满足生物活性测定、酶功能研究及半合成等下游应用，并有望扩展至其他萜类天然产物的定制化制备。
创新点
建立了一套易操作、低成本、无需昂贵设备即可在普通实验室开展的定制化二萜生产与纯化协议；通过模块化酶组合展示了从烯烃到氧化衍生物的多样化二萜生产；可同时兼容微生物和植物多宿主系统，并适用于其他萜类及天然产物。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (BL21(DE3)-C41) | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 增强二萜前体供给 |
| Escherichia coli (BL21(DE3)-C41) | MEP途径 | dxr | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶 | 催化 | 增强二萜前体供给 |
| Escherichia coli (BL21(DE3)-C41) | MEP途径 | id | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 增强二萜前体供给 |
| Escherichia coli (BL21(DE3)-C41) | 二萜生物合成 (dolabralexin) | GGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶 (来自Abies grandis) | 催化 | 催化IPP/DMAPP缩合生成GGPP |
| Escherichia coli (BL21(DE3)-C41) | 二萜生物合成 (dolabralexin) | ZmAN2 | ent-柯巴焦磷酸合酶 | 催化 | 催化GGPP环化形成ent-CDP |
| Escherichia coli (BL21(DE3)-C41) | 二萜生物合成 (dolabralexin) | ZmKSL4 | 二萜合酶 (kaurene synthase-like) | 催化 | 催化形成dolabradiene骨架 |
| Escherichia coli (BL21(DE3)-C41) | 二萜生物合成 (dolabralexin) | CYP71Z18 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 催化epoxydolabrene和epoxydolabranol生成 |
| Escherichia coli (BL21(DE3)-C41) | 二萜生物合成 (dolabralexin) | ZmCPR2 | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 为CYP71Z18提供还原力 |
| Nicotiana benthamiana | 无（辅助表达） | p19 | 基因沉默抑制蛋白p19 | 调控 | 抑制转基因沉默，增强外源基因表达 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 (dolabralexin) | ZmAN2 | ent-柯巴焦磷酸合酶 | 催化 | 利用植物内源GGPP合成ent-CDP |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 (dolabralexin) | ZmKSL4 | 二萜合酶 (kaurene synthase-like) | 催化 | 催化形成dolabradiene骨架 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 (dolabralexin) | CYP71Z18 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 催化15,16-epoxydolabrene生成 |
关键发现
- 以玉米dolabralexin途径为例，在E. coli中共表达ZmAN2、ZmKSL4、CYP71Z18和ZmCPR2，获得dolabradiene产量1.2±0.25 mg/L培养物、epoxydolabrene
- 65±0.2 mg/L、epoxydolabranol
- 4±1.1 mg/L；在本氏烟中瞬时共表达时，每克干叶片可提取dolabradiene
- 4±0.5 mg、15,16-epoxydolabrene
- 9±0.3 mg；硅胶柱层析和半制备HPLC可有效分离纯化不同极性的二萜产物。
研究结论
该可定制方法能够经济高效地生产并纯化二萜类天然产物，产物数量和纯度满足生物活性测定、酶功能研究及半合成等下游应用，且可扩展至其他萜类化合物。