A Cotyledon-based Virus-Induced Gene Silencing (Cotyledon-VIGS) approach to study specialized metabolism in medicinal plants
- 作者
- Yongliang Liu, Ruiqing Lyu, Joshua J. Singleton, Barunava Patra, Sitakanta Pattanaik, Ling Yuan
- 单位
- Department of Plant and Soil Sciences and Kentucky Tobacco Research and Development Center, University of Kentucky, Lexington, KY 40546, USA
- 杂志
- Plant Methods（2024）
- DOI
- 10.1186/s13007-024-01154-x
- 所属领域
- 植物功能基因组学
- 关键词
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解决的核心问题
传统病毒诱导基因沉默（VIGS）在幼嫩植株中效率不稳定，且在许多药用植物中未优化，需要开发一种快速、高效、广泛适用的VIGS方法用于研究药用植物特殊代谢。
研究策略
以5日龄黄化子叶为材料，通过真空渗透农杆菌进行VIGS，优化了苗龄、菌液浓度和渗透时间等条件，以叶绿素生物合成关键基因ChlH作为标记基因，并在长春花、胀果甘草和黄花蒿中验证，同时结合瞬时过表达实现多基因协同调控。
核心内容
该研究建立了一种基于子叶的病毒诱导基因沉默方法（Cotyledon-VIGS），用于药用植物特殊代谢途径的快速功能解析。研究以5日龄黄化子叶为材料，经真空渗透农杆菌优化了苗龄、菌液浓度和渗透时间等关键参数，并以叶绿素合成关键基因ChlH作为标记基因验证沉默效果。结果显示，在长春花中，5日龄幼苗配合OD600=0.5的菌液浓度可实现100%的ChlH沉默效率，ChlH表达降低约70%，叶绿素a和b含量显著下降；该方法同样在胀果甘草和黄花蒿中实现了100%的沉默效率。利用该方法进一步解析了长春花萜类吲哚生物碱的调控网络：沉默CrGATA1使文多灵含量下降而tabersonine积累，沉默CrMYC2后ORCA3表达降低80%；联合沉默两个抑制因子CrGBF1/2并过表达激活子CrMYC2，可使TDC和STR表达上调4至6倍。该平台在6天内即可获得表型，并能与瞬时过表达结合实现多基因协同操作，为非模式药用植物特殊代谢研究提供了高效通用的功能基因组学工具。
创新点
['首次建立基于子叶的VIGS方法，比传统方法更快更高效，6天内即可获得表型', '在三种药用植物中实现100%的VIGS沉默效率', '将基因沉默与瞬时过表达结合，成功实现同时沉默两个抑制子（CrGBF1/2）并过表达一个激活子（CrMYC2）', '提供了一种广泛适用于非模式植物的功能基因组学研究平台']
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus | 叶绿素生物合成 | CrChlH | 镁螯合酶H亚基 | 催化 | 作为VIGS标记基因，沉默导致子叶黄化，沉默效率最高达100% |
| Catharanthus roseus | 类胡萝卜素生物合成 | CrPDS | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 沉默后子叶无光漂白表型，但在真叶中观察到光漂白 |
| Catharanthus roseus | 文多灵生物合成 | CrGATA1 | GATA型锌指转录因子 | 调控 | 正向调控文多灵途径基因T3O、T3R和DAT |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成 | CrMYC2 | bHLH转录因子 | 调控 | 茉莉酸信号关键调控因子，调控ORCA2和ORCA3表达 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成 | CrGBF1 | G-box结合因子1 | 调控 | TIA生物合成抑制子，与CrGBF2同时沉默 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成 | CrGBF2 | G-box结合因子2 | 调控 | TIA生物合成抑制子，与CrGBF1同时沉默 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成 | ORCA2 | AP2/ERF转录因子 | 调控 | CrMYC2的靶基因，受MeJA诱导，沉默CrMYC2后下调 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成 | ORCA3 | AP2/ERF转录因子 | 调控 | CrMYC2的靶基因，受MeJA诱导，沉默CrMYC2后表达降低80% |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成 | TDC | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 催化色氨酸脱羧产生色胺，在CrGBF1/2沉默和CrMYC2过表达时上调4-6倍 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成 | STR | 异胡豆苷合酶 | 催化 | 催化色胺与裂环马钱子苷缩合产生异胡豆苷，在CrGBF1/2沉默和CrMYC2过表达时上调4-6倍 |
| Catharanthus roseus | 文多灵生物合成 | T3O | 他勃松3-加氧酶 | 催化 | 受CrGATA1正调控，沉默CrGATA1后表达下调 |
| Catharanthus roseus | 文多灵生物合成 | T3R | 他勃松3-还原酶 | 催化 | 受CrGATA1正调控，沉默CrGATA1后表达下调 |
| Catharanthus roseus | 文多灵生物合成 | DAT | 去乙酰文多灵-4-O-乙酰转移酶 | 催化 | 受CrGATA1正调控，沉默CrGATA1后表达下调 |
| Glycyrrhiza inflata | 叶绿素生物合成 | GiChlH | 镁螯合酶H亚基 | 催化 | VIGS标记基因，优化条件后沉默效率100% |
| Artemisia annua | 叶绿素生物合成 | AaChlH | 镁螯合酶H亚基 | 催化 | VIGS标记基因，优化条件后沉默效率100% |
关键发现
- 5日龄幼苗和OD600=0.5农杆菌浓度下CrChlH沉默效率达100%
- CrChlH表达降低70%，叶绿素a和b含量显著下降
- 沉默CrGATA1使表达降低约70%，导致T3O、T3R和DAT下调，vindoline含量下降、tabersonine含量上升
- 沉默CrMYC2使表达降低90%，在MeJA处理后ORCA2和ORCA3显著下调，其中ORCA3表达降低80%
- 同时沉默CrGBF1/2并过表达CrMYC2，CrMYC2过表达8倍，CrGBF1/2表达下调60-70%，TDC和STR表达上调4-6倍
- 在Glycyrrhiza inflata和Artemisia annua中，ChlH基因沉默效率均达100%。
研究结论
子叶VIGS是一种快速、高效、可广泛应用的基因功能研究方法，可与瞬时过表达结合，实现基因上调和下调的同步操作，为药用植物特殊代谢调控机制的研究提供了有力工具，有助于有价值治疗化合物的发现和生产。