Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme
- 作者
- Thiyagarajan Gnanasekaran, Konstantinos Vavitsas, Johan Andersen-Ranberg, Agnieszka Zygadlo Nielsen, Carl Erik Olsen, Björn Hamberger, Poul Erik Jensen
- 单位
- Department of Plant and Environmental Sciences, Copenhagen Plant Science Centre, UNIK Center for Synthetic Biology, Villum Research Center 'Plant Plasticity', University of Copenhagen, Thorvaldsensvej 40, DK-1871 Frederiksberg C, Copenhagen, Denmark; Present address: Plant and Microbial Biology, University of California, 371 Koshland Hall, Berkeley, CA 94720, USA
- 杂志
- Journal of Biological Engineering（2015）
- DOI
- 10.1186/s13036-015-0022-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在烟草叶片中异源表达异海松酸生物合成途径，并通过N端修饰促进细胞色素P450酶CYP720B4定位至叶绿体且保持活性，以提高二萜类化合物产量。
研究策略
利用农杆菌瞬时转化在Nicotiana benthamiana叶片中表达云杉异海松酸途径酶，共表达来自Plectranthus barbatus的限速酶DXS和GGPPs以增强前体供给；对CYP720B4进行N端截短（ΔTm）或Barnes修饰（删除7个氨基酸并引入点突变），并融合拟南芥铁氧还蛋白转运肽（Tp）以靶向叶绿体；通过GC-MS和LC-MS检测代谢产物，蛋白质印迹检测蛋白表达。
核心内容
本研究在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中异源重构了来自云杉的异海松酸生物合成途径，并针对关键细胞色素P450酶CYP720B4进行了N端修饰以促进其叶绿体定位。利用农杆菌介导的瞬时转化系统，共表达了途径酶及来自唇形科植物的限速酶DXS和GGPPs以增强前体供应。对CYP720B4采用跨膜螺旋截短或Barnes修饰（删除7个氨基酸并引入点突变），并融合拟南芥铁氧还蛋白转运肽。结果显示，共表达DXS和GGPPs使异海松二烯和异海松酸积累均提高3倍，浸润4天后异海松酸含量达45–55微克每克植物干重。删除或修饰CYP720B4跨膜螺旋不改变酶活性，但融合转运肽时需Barnes修饰以维持合适的膜锚定才能保持功能。色素分析表明共表达对光合色素无显著影响。该研究首次在植物叶绿体中完整重构云杉二萜途径，证明通过少量N端改造可促进植物P450在质体中的功能表达，为光驱动合成高价值萜类化合物提供了可行策略。
创新点
首次在植物叶绿体中完整重构来自云杉的二萜合成途径；证明CYP720B4的跨膜螺旋缺失或Barnes修饰不影响酶活性，且叶绿体靶向肽的功能需要合适的膜锚定；共表达DXS和GGPPs使异海松酸产量提高3倍。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 异海松酸生物合成途径 | diTPS-ISO | isopimara-7,15-diene synthase | 催化 | 将GGPP环化为异海松二烯（isopimaradiene） |
| Nicotiana benthamiana | 异海松酸生物合成途径 | CYP720B4 | 细胞色素P450酶CYP720B4 | 催化 | 将异海松二烯氧化为异海松酸；N端修饰（ΔTm或Barnes）不影响活性 |
| Nicotiana benthamiana | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 来自Plectranthus barbatus，共表达使二萜产量提高3倍 |
| Nicotiana benthamiana | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | GGPPs | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自Plectranthus barbatus，催化合成GGPP |
关键发现
- 共表达DXS和GGPPs使异海松二烯和异海松酸的积累均增加3倍
- 浸润后4天异海松酸积累达45-55 μg/g植物干重
- 删除或修饰CYP720B4跨膜螺旋不改变酶活性，但融合转运肽时需Barnes修饰（合适的膜锚定）才能保持活性
- 色素分析显示共表达DXS和GGPPs对光合色素组成无显著影响。
研究结论
可将云杉二萜途径完全定位于N. benthamiana叶绿体中，对CYP720B4 N端序列的少量修饰（如Barnes修饰）可促进植物P450在质体中的表达；将萜类生物合成与光合作用偶联，为光驱动合成高价值萜类化合物奠定基础。