Engineering Yarrowia lipolytica for the production of \beta-carotene by carbon and redox rebalancing
- 作者
- Hojun Lee, Jinwoo Song, Sang Woo Seo
- 杂志
- Journal of Biological Engineering（2025）
- DOI
- 10.1186/s13036-025-00476-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在解脂耶氏酵母中对中心碳代谢和氧化还原平衡进行重塑，以提高β-胡萝卜素的产量，并解决番茄红素底物抑制和辅因子供应不足等问题。
研究策略
通过迭代过表达β-胡萝卜素合成通路基因（carRP、carB、HMG1、GGPPs等），引入Y27R突变消除番茄红素抑制并恢复表达，工程化中心碳途径（磷酸戊糖途径、异源GapC/GapN、PK-PTA途径、PFK缺失）以增加NADPH再生和减少ATP消耗，并调节脂质合成通量（DGA1启动子替换）以平衡前体供给与产物储存。
核心内容
该研究通过系统重塑解脂耶氏酵母的中心碳代谢与氧化还原平衡，实现了β-胡萝卜素的高效生产。研究者首先迭代过表达β-胡萝卜素合成通路中的关键基因（包括carRP、carB、HMG1、GGPP合酶等），将初始菌株YB1仅6.9 mg/L的产量提升至YB4的493.9 mg/L。随后引入CarRP的Y27R突变以消除番茄红素底物抑制，虽然该突变降低了蛋白表达并导致产量下降至194.0 mg/L，但通过额外整合carRP/carB拷贝成功恢复产量且不再积累番茄红素。在中心碳代谢工程中，比较了PK-PTA途径与磷酸戊糖途径结合异源GapC/GapN的策略，发现后者更有效，其中表达异源GapN的菌株YB19产量达740.7 mg/L。最终通过用FBA1启动子替换DGA1启动子适度上调三酰甘油合成，菌株YB23产量达809.2 mg/L，产率为0.04 g/g葡萄糖，总产量较初始菌株提升约117倍。该工作证明了碳通量重分布与辅因子再平衡是强化微生物萜类合成的有效策略，为解脂耶氏酵母中类胡萝卜素及其他异戊二烯化合物的工业化生产提供了可行底盘。
创新点
首次在Y. lipolytica类胡萝卜素生产中重塑中心碳途径；发现Y27R突变虽消除底物抑制但降低蛋白表达，通过额外拷贝恢复；比较了PK-PTA途径与PP途径+GapC/GapN策略，发现后者更有效；通过适度上调DGA1实现了产量最大化。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | β-胡萝卜素合成 | carRP | CarRP（双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶） | 催化 | 来自Mucor circinelloides，含Y27R突变体 |
| Yarrowia lipolytica | β-胡萝卜素合成 | carB | CarB（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 来自Mucor circinelloides |
| Yarrowia lipolytica | 甲羟戊酸途径 | HMG1 | HMGR（3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶） | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | 类异戊二烯前体合成 | GGS1/GGPPxd | GGPP合酶（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶） | 催化 | 包括内源GGS1和异源GGPPxd（来自Xanthophyllomyces dendrorhous） |
| Yarrowia lipolytica | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | 甲羟戊酸途径 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | 磷酸戊糖途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | 磷酸戊糖途径 | GND1 | 6-磷酸葡糖酸脱氢酶 | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | 磷酸戊糖途径 | TKL1 | 转酮醇酶 | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | 磷酸戊糖途径 | TAL1 | 转醛醇酶 | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | 糖酵解/中心碳代谢 | gapC | NADP+依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum |
| Yarrowia lipolytica | 糖酵解/中心碳代谢 | gapN | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（推测NADP+依赖） | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum |
| Yarrowia lipolytica | 糖酵解 | PFK | 磷酸果糖激酶 | 催化 | 敲除株 |
| Yarrowia lipolytica | 脂质合成 | DGA1 | 二酰甘油酰基转移酶 | 催化 | 启动子替换为FBA1或TEFin |
| Yarrowia lipolytica | PK-PTA途径 | pk | 磷酸酮醇酶 | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum |
| Yarrowia lipolytica | PK-PTA途径 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 来自Thermoanaerobacterium saccharolyticum |
| Yarrowia lipolytica | 形态发生调控 | MHY1 | 转录因子 | 调控 | 删除以抑制菌丝形成 |
关键发现
- 初始菌株YB1仅产6.9 mg/L β-胡萝卜素
- 过表达HMGR和GGPPs后YB4达493.9 mg/L
- 引入Y27R突变后降至194.0 mg/L
- 通过整合额外carRP/carB拷贝恢复至约493.9 mg/L且无番茄红素积累
- 中心碳工程中，PK-PTA途径菌株YB15产682.8 mg/L，异源gapC表达(YB17)产697.0 mg/L，异源gapN表达(YB19)产740.7 mg/L
- 进一步用FBA1启动子替换DGA1启动子（YB23）产量达809.2 mg/L，生产率为0.017 g/L/h，产率为0.04 g/g葡萄糖。最高产量比初始提高了约117倍。
研究结论
通过迭代过表达通路基因、中心碳途径工程和脂质通量调整，成功开发了产β-胡萝卜素的Y. lipolytica底盘菌株，证明了碳通量重分布是提高微生物萜类生产的有效策略。