Biosynthesis, regulation, and engineering of microbially produced branched biofuels
- 作者
- Wenqin Bai, Weitao Geng, Shaojie Wang, Fuzhong Zhang
- 单位
- Department of Energy, Environmental and Chemical Engineering, Washington University in St. Louis, Saint Louis, MO 63130, USA; Division of Biological & Biomedical Sciences, Washington University in St. Louis, Saint Louis, MO 63130, USA; Institute of Materials Science & Engineering, Washington University in St. Louis, Saint Louis, MO 63130, USA
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2019）
- DOI
- 10.1186/s13068-019-1424-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
直链生物燃料在能量密度、吸湿性、低温性能等方面存在不足，支链生物燃料具有更高的辛烷值、更好的低温流动性和更低的浊点，但它们的生物合成与调控机制尚不清晰，且产量较低，难以经济规模化生产。本综述旨在系统总结微生物合成支链生物燃料（包括支链短链醇/酯、末端支链长链脂肪酸及其衍生物、内部支链脂肪酸）的途径、调控和工程化进展，以指导高效生产菌株的设计。
研究策略
综述多种支链生物燃料的生物合成途径（如Ehrlich途径、支链脂肪酸合成途径、环丙烷脂肪酸合成途径等），分析其转录调控和酶学特性，并总结近年来通过异源表达、竞争途径删除、前体供给增强、辅因子平衡、蛋白工程等代谢工程策略提高产量的研究案例。
核心内容
该综述系统梳理了微生物合成支链生物燃料的代谢途径、调控机制与工程化策略，涵盖支链短链醇/酯、末端支链长链脂肪酸及衍生物和内部支链脂肪酸三大类产物。作者比较了酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌及蓝藻等多种底盘中的合成路线，重点分析了Ehrlich途径、支链脂肪酸合酶系统以及环丙烷脂肪酸合成途径的关键酶和转录调控元件。在工程策略方面，综述总结了异源表达、竞争途径删除、前体供给强化、辅因子平衡以及FabH底物特异性替换等手段。关键数据方面，重构Ehrlich途径并过表达ilvIHCD使大肠杆菌异丁醇产量达22 g/L；在酿酒酵母中替换FabH并工程化脂酰化途径后，末端支链脂肪酸产量由初始的2.5 mg/L提升至207 mg/L，提高48倍。综述指出，支链燃料在辛烷值和低温性能上优于直链燃料，但当前产量仍不足以支撑经济规模化生产，未来需借助模型指导的途径优化、生物传感器高通量筛选和动态调控等工具进一步突破，并向工业宿主转移。
创新点
系统覆盖了从短链(C4-C8)到长链(C15-C19)的支链醇、烷烃和酯类燃料；重点阐述了末端支链和内部支链脂肪酸的不同合成路线；总结了通过更换FabH底物特异性、重建脂酰化途径、动态调控表达等创新策略提高支链脂肪酸占比和产量的最新进展，并指出内部支链脂肪酸（如结核硬脂酸、环丙烷脂肪酸）作为未来生物燃料的潜力。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich途径 | ARO10 | Aro10p (α-酮酸脱羧酶) | 催化 | 催化支链α-酮酸脱羧生成相应醛；来自酿酒酵母，也可在谷氨酸棒杆菌中表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich途径 | ADH6 | Adh6p (醇脱氢酶) | 催化 | 还原醛生成支链醇，如异丁醇 |
| Saccharomyces cerevisiae | 缬氨酸/异亮氨酸生物合成 | ILV2 | Ilv2p (乙酰乳酸合酶) | 催化 | 催化丙酮酸生成乙酰乳酸，增强2-酮异戊酸前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich途径调控 | ARO80 | Aro80p (转录激活因子) | 调控 | 响应芳香族氨基酸，激活ARO9和ARO10转录；热激下也参与激活 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich途径调控 | PDR12 | Pdr12p (转运蛋白) | 转运 | 外排芳香族和支链有机酸，由War1p诱导 |
| Escherichia coli | Ehrlich途径 | ilvIHCD | 乙酰乳酸合酶/还原异构酶/脱水酶 | 催化 | 增强2-酮异戊酸合成，用于异丁醇生产，配合敲除adhE、ldhA、frdAB、fnr、pta等 |
| Escherichia coli | 末端支链脂肪酸生物合成 | fabH2, bkd操纵子 | FabH2 (β-酮脂酰-ACP合酶III) 和支链α-酮酸脱氢酶 | 催化 | 来自枯草芽孢杆菌，异源表达构建支链脂肪酸合成途径；初始产量仅2.5 mg/L |
| Escherichia coli | 末端支链脂肪酸生物合成 | lipB, lipA | LipB脂酰转移酶和LipA脂酰合酶 | 催化 | 修复因bkd过表达导致的α-酮酸脱氢酶脂酰化缺陷，使支链脂肪酸产量提高至207 mg/L |
| Escherichia coli | 支链长链脂肪醇合成 | 源自Photorhabdus luminescens的脂肪酸还原酶复合物相关基因 | 脂肪酸还原酶复合物 | 催化 | 将支链酰基-ACP还原为醇；最佳菌株产BLFLs 350 mg/L，其中75%为支链脂肪醇 |
| Escherichia coli | 支链烷烃合成 | 脂肪酸还原酶复合物和醛脱羰酶基因 | 脂肪酸还原酶和醛脱羰酶 | 催化 | 来自Photorhabdus luminescens和Nostoc punctiforme，可合成甲基十五烷等支链烷烃 |
| Escherichia coli | 结核硬脂酸(TSBA)生物合成 | bfaA, bfaB | BfaA (FAD依赖氧化还原酶) 和BfaB (SAM依赖甲基转移酶) | 催化 | 来自Mycobacterium chlorophenolicum，单独表达即可从油酸合成TSBA |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 环丙烷脂肪酸合成 | cfa | Cfa (环丙烷脂肪酸合酶) | 催化 | 来自大肠杆菌，将SAM的亚甲基转移到UFA双键形成环丙烷环，占总脂肪酸的30% |
| Arabidopsis thaliana | 环丙烷脂肪酸合成 | cfa, SfLPA | Cfa和SfLPA (溶血磷脂酸酰基转移酶) | 催化 | 种子中单独表达cfa时CFA占9.1%，共表达SfLPA后提高至35% |
| Bacillus subtilis | 末端支链脂肪酸生物合成 | bkd操纵子 | 支链α-酮酸脱氢酶 (BKD) | 催化 | 天然途径，将支链α-酮酸转化为支链酰基-CoA，作为末端支链脂肪酸的前体 |
| Corynebacterium glutamicum | Ehrlich途径 | aro10 (来自S. cerevisiae), yqhD (来自E. coli) | Aro10p和YqhD醇脱氢酶 | 催化 | 利用天然积累的2-酮酸前体，生产3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-丁醇产量2.76 g/L |
关键发现
- 酿酒酵母中过表达KDC和Adh6p并敲除PDC1，异丁醇产量达143 mg/L，比野生型高13倍
- 进一步敲除LPD1并过表达MAE1，异丁醇产量达1.62 g/L。大肠杆菌中重构Ehrlich途径并过表达ilvIHCD，异丁醇产量达22 g/L。枯草芽孢杆菌中异丁醇产量为2.62 g/L。谷氨酸棒杆菌中3-甲基-1-丁醇产量达2.76 g/L。R. eutropha利用CO2和电还原力产3-甲基-1-丁醇和异丁醇共140 mg/L。集胞藻PCC 6803产异丁醇450 mg/L。通过过表达ATF1，异丁醇乙酸酯、3-甲基-1-丁基乙酸酯、2-甲基-1-丁基乙酸酯产量分别达260.2、296.1和289.6 mg/L。大肠杆菌中异丁基乙酸酯产量达17.2 g/L。脂肪酸短链酯产量209±2.6 mg/L，其中50%为支链酯。大肠杆菌中初始末端支链脂肪酸仅2.5 mg/L，替换FabH后提高48倍，再工程化脂酰化途径后达207 mg/L。支链长链脂肪醇产量350 mg/L，其中75%为支链。同时含支链酸和醇的酯产量35 mg/L，产率1.9 mg/g甘油。环丙烷脂肪酸在集胞藻中占总脂肪酸的30%，在拟南芥种子中单独表达cfa时为9.1%，共表达SfLPA后达35%。
研究结论
支链生物燃料相比直链燃料具有更优异的燃料特性，但目前产量和产率仍不足以支持经济可行的规模化生产。未来需要借助建模指导的途径优化、代谢物生物传感器高通量筛选、动态调控和微生物群体控制等工具，进一步提升产量、得率和生产稳定性，并逐步转移到工业相关宿主中实现低成本可持续生产。