Synthetic biology toolkit for engineering Cupriviadus necator H16 as a platform for CO2 valorization
- 作者
- Haojie Pan, Jia Wang, Haoliang Wu, Zhongjian Li, Jiazhang Lian
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2021）
- DOI
- 10.1186/s13068-021-02063-0
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
Cupriavidus necator H16虽然具有CO2固定能力，但缺乏系统化的合成生物学工具和工程策略，难以高效转化为高附加值产品。
研究策略
系统综述了C. necator H16的合成生物学工具箱（包括遗传工程载体、异源基因表达元件、平台菌株与基因组编辑、转化方法），并讨论了将这些工具应用于CO2生产醇类、脂肪酸和萜烯等产品的案例。
核心内容
该文系统综述了Cupriavidus necator H16作为CO2固定平台菌株的合成生物学工具箱及其应用进展。作者梳理了遗传操作载体、启动子等异源表达元件、基因组编辑工具（如CRISPR/Cas9）以及转化方法，并整合了将这些工具用于以CO2为底物生产醇类、脂肪酸和萜烯等产品的案例。关键结果表明，Pj5启动子强度约为Ptac的5倍，Ptrc比PphaCl强至少20倍；优化的电穿孔效率达(3.86±0.29)×10^5 cfu/μg DNA，敲除限制修饰系统后效率提升10^3倍以上。在应用层面，异丙醇在气体发酵中产量达7.7±0.2 g/L，2,3-丁二醇产量达32.0±0.1 g/L，脂肪酸产量达60.64 mg/g CDW；密码子优化使异丙醇产量提高8.9±3.0倍，适应性进化使突变株在甘油中的比生长速率比野生型快9.5倍。这些结果表明该菌株的工程化改造已取得显著成效，但工具效率和便捷性仍有提升空间，未来需开发更成熟的方法以实现CO2向高附加值化学品的规模化生物转化。
创新点
全面系统总结了C. necator H16的合成生物学工具，首次系统梳理了这些工具在CO2增值中的应用，提出了选择策略和未来发展方向。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cupriavidus necator H16 | Calvin-Benson-Basham (CBB) cycle | cbbL | Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO) | 催化 | CO2固定关键酶，CBB循环中的核心羧化酶 |
| C. necator H16 | 聚羟基丁酸酯(PHB)合成 | phaCAB (phaC, phaA, phaB) | PHA合酶(PhaC)、β-酮硫解酶(PhaA)、乙酰乙酰CoA还原酶(PhaB) | 催化 | PHB合成途径，通常被敲除或作为整合位点以重定向碳流 |
| C. necator H16 | Entner-Doudoroff(ED)途径 | eda | 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶 | 催化 | ED途径关键酶，其缺失可用于营养缺陷互补筛选 |
| C. necator H16 | 氢化酶系统 | hoxABCJ (hoxA, hoxB, hoxC, hoxJ) | [NiFe]-氢化酶（可溶性和膜结合型） | 能量供给 | 氧化氢气提供还原力，支持CO2固定 |
| C. necator H16 | 异丙醇合成 | adc, adh, thl, ctf | 乙酰乙酸脱羧酶(ADC)、醇脱氢酶(ADH)、硫解酶(THL)、辅酶A转移酶(CTF) | 催化 | 从乙酰辅酶A经乙酰乙酰CoA合成异丙醇，异源表达于C. necator |
| C. necator H16 | 脂肪酸合成 | tesA, fadB, acc | 硫酯酶(TesA)、脂酰CoA脱氢酶(FadB)、乙酰CoA羧化酶(ACC) | 催化 | 用于脂肪酸衍生燃料/化学品的生产，需删除β-氧化 |
| C. necator H16 | 甲羟戊酸途径（萜烯合成） | erg20, hmgS, hmgR, mvaK, mvaD, mvaK2, fni | 法尼基焦磷酸合酶(Erg20)、HMG-CoA还原酶(HmgR)、甲羟戊酸激酶(MvaK)等 | 催化 | 用于α-humulene、番茄红素等萜烯合成 |
| C. necator H16 | 基因表达调控 | lacI, tetR, araC, rhaRS | 转录调控因子LacI、TetR、AraC、RhaRS | 调控 | 用于构建诱导型表达系统，如IPTG、四环素、阿拉伯糖、鼠李糖诱导 |
| C. necator H16 | 蛋白质分泌 | hoxK | 膜结合[NiFe]-氢化酶小亚基HoxK | 转运 | 其Tat信号肽引导重组蛋白分泌至周质或胞外 |
| C. necator H16 | PHB颗粒表面展示 | phaP | phasin (PhaP) | 区室化 | PhaP锚定于PHB颗粒表面，可用于蛋白固定化和通路区室化 |
关键发现
- Pj5启动子强度约为Ptac的5倍，Ptrc至少比PphaCl强20倍
- 基于pBBR1的质粒在无抗生素条件下经四次传代后，在MM和LB中分别约有95%和80%丢失，RSF1010质粒在70小时后仅10%的细胞保留质粒
- 优化的电穿孔效率达到(3.86±0.29)×10^5 cfu/μg DNA，敲除RM基因后效率提高10^3倍以上
- CRISPR/Cas9在C. necator中的编辑效率为78.3%-100%
- 异丙醇产量在气体发酵中达7.7±0.2 g/L，在MES系统中达600 mg/L
- 2,3-丁二醇产量达32.0±0.1 g/L
- 脂肪酸产量达60.64 mg/g CDW
- α-humulene达17 mg/g CDW
- 番茄红素在MES中达1.73 mg/L
- 密码子优化使异丙醇产量提高8.9±3.0倍，额外拷贝adh再提高1.20±0.18倍
- 适应性进化使C. necator变体v6C6在甘油中的比生长速率比野生型快9.5倍。
研究结论
C. necator H16的遗传工程工具和合成生物学应用已取得巨大进展，但仍需进一步开发更高效便捷的工具，以实现CO2向高附加值产品的高效转化。