Identification of functional butanol-tolerant genes from Escherichia coli mutants derived from error-prone PCR-based whole-genome shuffling

作者: Xueting He, Tingli Xue, Yuanyuan Ma, Junyan Zhang, Zhiquan Wang, Jiefang Hong, Lanfeng Hui, Jianjun Qiao, Hao Song, Minhua Zhang
单位: Biomass Conversion Laboratory, R&D Center for Petrochemical Technology, Tianjin University; Department of Biochemical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University; Frontier Technology Research Institute, Tianjin University; Collaborative Innovation Centre of Chemical Science and Engineering (Tianjin); Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), SynBio Research Platform, Tianjin University; Tianjin Key Laboratory of Pulp and Paper, Tianjin University of Science and Technology
杂志: Biotechnology for Biofuels（2019）
DOI: 10.1186/s13068-019-1405-z
所属领域: 代谢工程
关键词: AcrBButanol-tolerant mutantsComparative functional genomeEfflux pumpEscherichia coliQuorum-sensing signal transporterRobTranscription regulator factor
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解决的核心问题

丁醇对菌株的毒性限制了生物丁醇的高产，需开发丁醇耐受菌株并鉴定功能性丁醇耐受基因，以阐明耐受机制并指导菌株改造。

研究策略

采用易错PCR全基因组改组技术快速获得丁醇耐受突变株，结合全基因组重测序、PCR验证及功能互补实验，比较功能基因组学鉴定关键耐受基因，并通过基因组定点突变和缺失验证基因功能。

研究路线图

100%

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核心内容

本研究通过易错PCR全基因组改组技术快速构建了大肠杆菌丁醇耐受突变株，并系统鉴定了功能性耐受基因。研究者从野生型BW25113出发，经全基因组改组获得两株稳定耐受2%（v/v）丁醇的突变株BW1847和BW1857，其最大细胞密度较野生型分别提高5.0倍和3.6倍。通过全基因组重测序和功能互补实验，发现acrB C1198T点突变、rob基因AT686-7缺失及tqsA缺失是关键的耐受决定因素。进一步构建的基因组定点突变株DT385和DT900在0.75%丁醇下最大细胞密度分别提高1.6倍和1.9倍，培养基中丁醇浓度达5.37–5.78 g/L，而相对胞内丁醇含量从对照的2.72 g/L/OD600降至0.60和0.54 g/L/OD600，证实acrB和rob突变增强了丁醇外排能力。tqsA缺失株在1.5%丁醇下生长改善达82.8%。这些发现首次报道了acrB缺失可增强丁醇外排，为理性设计高丁醇耐受菌株提供了明确靶点和机制基础。

创新点

首次将易错PCR全基因组改组应用于大肠杆菌丁醇耐受育种；发现acrB和rob的失活突变以及tqsA缺失可显著提高丁醇耐受；首次报道acrB缺失增强丁醇外排能力。

研究对象（5）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli BW25113	丁醇耐受	acrB	AcrB	转运	编码多药外排RND转运蛋白亚基；C1198T突变或缺失导致蛋白失活，增强丁醇外排能力，提高丁醇耐受
Escherichia coli BW25113	丁醇耐受	rob	Rob	调控	编码AraC家族转录激活因子；AT686-7缺失导致功能失活，改变基因表达谱从而增强丁醇耐受
Escherichia coli BW25113	丁醇耐受	tqsA	TqsA	转运	编码AI-2群体感应信号转运蛋白；缺失提高细胞内AI-2浓度，增强细胞运动和生物膜形成，改善高浓度丁醇耐受
Escherichia coli BW1847	丁醇耐受	—	—	—	通过两轮易错PCR全基因组改组获得的丁醇耐受突变株，含9个SNP和14-kb缺失，耐受2%丁醇
Escherichia coli BW1857	丁醇耐受	—	—	—	通过两轮易错PCR全基因组改组获得的丁醇耐受突变株，含7个SNP和14-kb缺失，耐受2%丁醇

关键发现

获得两株耐受2% (v/v)丁醇的突变株BW1847和BW1857，其最大OD600分别为0.69和0.50，较野生型BW25113提高5.0倍和3.6倍
在1.5%丁醇下细胞密度较对照提高68%和204%
在1.6%和1.8%丁醇下提高1.5/2.7倍和3.5/5.9倍。两株菌共有5个共同SNP及一个14-kb缺失。功能互补实验表明acrB C1198T突变、rob AT686-7缺失及tqsA缺失是关键耐受因素。基因组定点突变株DT385（acrB C1198T）和DT900（rob AT686-7缺失）在0.75%丁醇下最大细胞密度分别提高1.6倍和1.9倍，培养基中丁醇浓度达5.37–5.78 g/L（对照4.89 g/L），相对胞内丁醇含量为0.60和0.54 g/L/OD600（对照2.72 g/L/OD600），表明外排能力增强。tqsA缺失株D380在1%、1.25%、1.5%丁醇下生长改善分别为34.6%、67.8%和82.8%。

研究结论

通过易错PCR全基因组改组快速获得两个稳定且高浓度丁醇耐受的大肠杆菌突变株，并利用比较功能基因组学鉴定出三个关键丁醇耐受基因rob、acrB和tqsA，其突变或缺失可提高丁醇耐受性，为理性构建丁醇耐受菌株提供了靶点和机制见解。