Gene targets for engineering osmotolerance in Caldicellulosiruptor bescii
- 作者
- Kyle B. Sander, Daehwan Chung, Dawn M. Klingeman, Richard J. Giannone, Miguel Rodriguez Jr., Jason Whitham, Robert L. Hettich, Brian H. Davison, Janet Westpheling, Steven D. Brown
- 单位
- Oak Ridge National Laboratory; University of Tennessee, Knoxville; University of Georgia, Athens; University of California, Berkeley; National Renewable Energy Laboratory; LanzaTech; Becton Dickinson Diagnostics
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2020）
- DOI
- 10.1186/s13068-020-01690-3
- 所属领域
- 代谢工程、合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
Caldicellulosiruptor bescii作为整合生物加工（CBP）的候选生物催化剂，在升高的渗透压下生长差、转化率低，需要提高其对高渗透压的耐受性以满足CBP工艺要求。
研究策略
从10个调控基因缺失突变株中筛选渗透压耐受性差异表型，结合全基因组重测序、转录组（RNA-seq）和蛋白质组学分析，鉴定影响渗透压耐受性的关键基因和调控机制，并通过遗传互补和过表达验证。
核心内容
本研究以嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor bescii为对象，探索提高其渗透压耐受性以改善整合生物加工效率的代谢工程策略。通过比较10个调控基因缺失突变株在高渗条件下的生长表型，发现fapR缺失菌株ORCB001在乙醇、NaCl、甘油或葡萄糖存在时生长严重受损，而fruR/cra缺失菌株ORCB002在200 mOsm/L NaCl下生长速率约为0.4 h⁻¹，是亲本JWCB005的3倍以上，且400 mOsm/L NaCl下滞后时间从47小时缩短至15小时。转录组分析显示FapR负调控脂肪酸生物合成及丙二酰-CoA代谢基因簇（表达上调最高达log2 3.9），证实新发现的脂肪酸通路与渗透压响应相关；而ORCB002中果糖PTS和磷酸果糖激酶基因在甘油或NaCl条件下上调最高达log2 4.8，但葡萄糖条件下无变化。全基因组重测序揭示ORCB002除fruR/cra缺失外还携带16个缺失、1个移码及dnaK T516A替换等隐蔽突变，遗传互补实验表明其耐受增强并非直接源于fruR/cra缺失，而可能由dnaK等次要突变介导。该工作首次在C. bescii中建立FapR调控的脂肪酸合成与渗透压耐受的联系，为靶向调控因子改良菌株耐渗性提供可行方向，同时警示突变体筛选过程中隐藏遗传变异对表型归因的干扰。
创新点
首次在C. bescii中鉴定出FapR调控的脂肪酸生物合成通路与渗透压耐受性相关；发现fruR/cra缺失菌株的渗透压耐受增强表型意外地并非由该基因缺失本身引起，而是与dnaK等次要突变有关；利用全基因组重测序揭示菌株中隐藏的基因组变异。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Caldicellulosiruptor bescii | 脂肪酸生物合成 | fapR (BSX54_RS06355) | FapR | 调控 | 转录因子，负调控脂肪酸生物合成和丙二酰-CoA代谢；缺失导致渗透压敏感性增加。 |
| Caldicellulosiruptor bescii | 果糖代谢 | fruR/cra (BSX54_RS01260) | FruR/Cra | 调控 | 转录因子，调控相邻果糖PTS基因和全局碳代谢；其缺失菌株的耐渗透压表型可能源于次要突变而非该基因本身。 |
| Caldicellulosiruptor bescii | 应激响应/蛋白折叠 | dnaK (BSX54_RS08370) | DnaK | 调控 | 分子伴侣，存在T516A非沉默替换突变，与渗透压耐受性潜在相关。 |
| Caldicellulosiruptor bescii | 脂肪酸生物合成 | BSX54_RS06360 | 磷酸酰基转移酶 | 催化 | FapR调控的脂肪酸生物合成基因之一，在fapR缺失菌株中表达上调（log2变化3.9）。 |
| Caldicellulosiruptor bescii | 脂肪酸生物合成 | BSX54_RS06365 | 酮脂酰-ACP合酶III | 催化 | FapR调控的脂肪酸生物合成基因之一，在fapR缺失菌株中表达上调（log2变化3.8）。 |
| Caldicellulosiruptor bescii | 果糖代谢 | BSX54_RS01265 | 1-磷酸果糖激酶 | 催化 | 与fruR/cra相邻，在fruR/cra缺失菌株中于甘油/NaCl条件下上调（log2变化4.2/4.5）。 |
| Caldicellulosiruptor bescii | 果糖PTS | BSX54_RS01270-01280 | PTS果糖转运蛋白亚基IIA/IIBC及HPr | 转运 | 果糖特异性磷酸转移酶系统组分，在fruR/cra缺失菌株中显著上调。 |
| Caldicellulosiruptor bescii | 碳水化合物转运 | SAMN04515608_2488 | CUT1家族碳水化合物ABC转运体底物结合蛋白 | 转运 | 在ORCB002中检测到两个相邻氨基酸替换（A28V和T27A）。 |
关键发现
- 筛选10个调控基因缺失突变株，发现ORCB001（ΔfapR）在高渗透压（添加乙醇、NaCl、甘油或葡萄糖）下生长严重缺陷，而ORCB002（ΔfruR/cra）在200 mOsm/L NaCl下生长速率约为0.4 h⁻¹，是其遗传亲本JWCB005（约0.12 h⁻¹）的3倍以上
- 在400 mOsm/L NaCl下，ORCB002滞后时间为15 h，亲本为47 h。ORCB002基因组重测序发现16个缺失/部分缺失、3个替换突变、1个沉默突变和1个移码突变，其中dnaK（BSX54_RS08370）存在T516A替换。转录组分析表明，FapR缺失导致脂肪酸生物合成（BSX54_RS06360-06395）和丙二酰-CoA代谢（BSX54_RS07175-07190）基因表达上调（log2变化最高3.9），证实FapR负调控这些通路
- FruR/Cra缺失菌株中果糖PTS和磷酸果糖激酶基因（BSX54_RS01265-01290）在甘油或NaCl条件下上调（log2最高4.8），但在葡萄糖条件下无显著变化。
研究结论
两个系统可影响C. bescii的渗透压耐受性：一是脂肪酸生物合成（受FapR调控），二是由ORCB002中一个或多个非预期的次要突变（候选包括dnaK）所介导。虽然具体位点和机制尚不明确，但研究展示了靶向调控因子（fapR）改善渗透压耐受的潜力，也揭示了突变株中隐藏遗传变异的挑战。