Metabolic engineering of Yarrowia lipolytica for thermoresistance and enhanced erythritol productivity
- 作者
- Nan Wang, Ping Chi, Yawen Zou, Yirong Xu, Shuo Xu, Muhammad Bilal, Patrick Fickers, Hairong Cheng
- 单位
- State Key Laboratory of Microbial Metabolism, and School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University; School of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Technology; Microbial Process and Interaction, TERRA Teaching and Research Centre, University of Liege - Gembloux Agro-Bio Tech
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2020）
- DOI
- 10.1186/s13068-020-01815-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇时产量和产率低，且产生甘露醇和D-阿拉伯醇等副产物，并能在非胁迫条件下分解赤藓糖醇；同时发酵过程需要冷却，成本高。
研究策略
通过敲除副产物合成基因（MDH2）、赤藓糖醇分解基因（EYD1），过表达酿酒酵母泛素连接酶基因RSP5以提高耐热性，过表达ZWF1和GND1增强NADPH供应，并敲除Ku70促进同源重组，从而构建高效生产赤藓糖醇的工程菌。
核心内容
针对解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇时产量低、副产物多且发酵需冷却的问题，该研究通过组合代谢工程构建了高效耐热的工程菌HCY118。首先系统鉴定了5个甘露醇/D-阿拉伯醇脱氢酶基因，确定MDH2为葡萄糖培养基中的关键副产物合成酶并予以敲除，同时敲除赤藓糖醇分解基因EYD1，避免产物被重新利用；接着引入酿酒酵母泛素连接酶基因RSP5增强耐热性，并过表达磷酸戊糖途径的ZWF1和GND1以强化NADPH供应。最终工程菌HCY118在2-L摇瓶中赤藓糖醇产量达190 g/L、产率0.63 g/g，在30 m³发酵罐中分别达到196 g/L和0.65 g/g；在33°C下，产量、产率、生产强度较野生型分别提高31%、31.3%和62.8%。此外，敲除MDH2使产量提高7.9%，敲除EYD1再增8%，且菌株不再产生甘露醇和D-阿拉伯醇。结果表明该策略有效提升了赤藓糖醇生产效率并降低了冷却与纯化成本，具备工业应用潜力。
创新点
1. 系统鉴定并表征了5个甘露醇/D-阿拉伯醇脱氢酶基因，发现MDH2是唯一在葡萄糖培养基中发挥主要作用的甘露醇脱氢酶；2. 敲除EYD1阻断赤藓糖醇分解，避免终产物重新利用；3. 引入酿酒酵母RSP5基因使菌株耐热性提高，可在33°C高效生产；4. 过表达ZWF1和GND1增强NADPH供应，提高赤藓糖醇产量。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica CGMCC7326 | 甘露醇合成途径 | MDH2 (YALI0D18964g) | 甘露醇脱氢酶 (Mdh) | 催化 | 敲除该基因后，甘露醇和D-阿拉伯醇合成均被阻断，赤藓糖醇产量提高7.9% |
| Yarrowia lipolytica CGMCC7326 | 甘露醇/D-阿拉伯醇代谢 | AraDH1 (YALI0F02211g) | D-阿拉伯醇脱氢酶 1 | 催化 | 体外具有甘露醇和D-阿拉伯醇脱氢酶活性，但在葡萄糖条件下敲除对副产物合成无明显影响 |
| Yarrowia lipolytica CGMCC7326 | 甘露醇/D-阿拉伯醇代谢 | AraDH2 (YALI0E05643g) | D-阿拉伯醇脱氢酶 2 | 催化 | 体外具有甘露醇和D-阿拉伯醇脱氢酶活性，但敲除无表型变化 |
| Yarrowia lipolytica CGMCC7326 | 甘露醇合成途径 | MDH1 (YALI0B16192g) | 甘露醇脱氢酶 1 | 催化 | 体外具有甘露醇脱氢酶活性，但敲除不影响甘露醇合成 |
| Yarrowia lipolytica CGMCC7326 | 木糖醇代谢 | XDH1 (YALI0E12463g) | 木糖醇脱氢酶 | 催化 | 体外具有木糖醇脱氢酶活性，敲除对甘露醇和D-阿拉伯醇合成无影响 |
| Yarrowia lipolytica CGMCC7326 | 赤藓糖醇分解途径 | EYD1 (YALI0F01650g) | 赤藓糖醇脱氢酶 | 催化 | 敲除该基因使菌株不能分解赤藓糖醇，产量提高8% |
| Yarrowia lipolytica CGMCC7326 | 热应激响应/泛素-蛋白酶体途径 | RSP5 (S. cerevisiae) | 泛素连接酶 Rsp5 | 调控 | 过表达该基因使菌株可在35°C生长，33°C保持高效生产赤藓糖醇 |
| Yarrowia lipolytica CGMCC7326 | 磷酸戊糖途径 | ZWF1 (YALI0E22649g) | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 过表达以再生NADPH，增强赤藓糖醇合成 |
| Yarrowia lipolytica CGMCC7326 | 磷酸戊糖途径 | GND1 (YALI0B15598g) | 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 | 催化 | 过表达以再生NADPH，增强赤藓糖醇合成 |
关键发现
- 工程菌HCY118在2-L摇瓶中，赤藓糖醇产量190 g/L、产率0.63 g/g、生产强度1.97 g/L·h
- 在30 m³发酵罐中分别达到196 g/L、0.65 g/g和2.51 g/L·h。在33°C下，HCY118的产量、产率、生产强度和细胞生产速率比野生型CGMCC7326分别提高31%、31.3%、62.8%和41.15%。敲除MDH2使赤藓糖醇产量提高7.9%（从164 g/L到177 g/L），敲除EYD1再提高8%。HCY118不产生甘露醇和D-阿拉伯醇，且无法分解赤藓糖醇。在34°C和35°C下产量分别下降14.7%和30.5%。
研究结论
通过组合代谢工程成功构建了耐热、NADPH供应增强、无副产物且不消耗赤藓糖醇的工程菌HCY118，显著提高了赤藓糖醇的生产效率，并降低了冷却和纯化成本，具有工业应用价值。