Escherichia coli displays a conserved membrane proteomic response to a range of alcohols

作者: Oishi Sen, Jamie Hinks, Qifeng Lin, Qingsong Lin, Staffan Kjelleberg, Scott A. Rice, Thomas Seviour
单位: Singapore Centre for Environmental Life Sciences Engineering, Nanyang Technological University, Singapore, Singapore; School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore, Singapore; Department of Biological Sciences, Faculty of Science, National University of Singapore, Singapore, Singapore; School of Biological, Earth and Environmental Sciences, University of New South Wales, Sydney 2052, Australia; The Australian Institute for Microbiology and Immunology, University of Technology Sydney, Sydney 2007, Australia; CSIRO, Agriculture and Food, Westmead and Microbiomes for One Systems Health, Sydney, Australia; WATEC Aarhus University Centre for Water Technology, Universitetsbyen 36, Bldg 1783, 8000 Aarhus, Denmark
杂志: Biotechnology for Biofuels（2023）
DOI: 10.1186/s13068-023-02401-4
所属领域: 代谢工程
关键词: Bacterial stress responseBioalcoholE. coli membrane proteomeOmpC
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解决的核心问题

酒精对微生物的固有毒性导致产物抑制，限制大规模发酵生产生物醇；对微生物酒精胁迫响应机理认识不足，尤其是膜蛋白质组对不同链长酒精的响应规律不清楚。

研究策略

以E. coli为模型，通过SWATH-MS定量蛋白质组学比较乙醇、丁醇、己醇在MIC50浓度下膜蛋白质组的变化；利用葡萄糖补充提高酒精MIC50以增强分辨率；通过SDS-PAGE和MRM^HR靶向质谱验证关键蛋白变化；通过EDTA处理排除LPS释放对OmpC降低的影响。

研究路线图

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核心内容

该研究以大肠杆菌为模型，利用SWATH-MS定量蛋白质组学比较了乙醇、丁醇和己醇在最低抑菌浓度（MIC50）下对膜蛋白质组的影响，并通过葡萄糖补充提高MIC50以增强分辨率。共定量206个膜蛋白，发现大肠杆菌对C2-C6醇存在保守的膜蛋白响应：能量代谢和转运蛋白上调（如丁醇下PtkC log2FC>4.6、己醇下SbmA log2FC≈3.71），肽聚糖降解酶上调（丁醇下MltA约5倍、DigH约5.1倍），而多数外膜β-桶蛋白下调。外膜蛋白OmpC在所有醇胁迫下均显著降低（降至≤26%），且经EDTA处理后证实该降低与LPS释放无关，OmpA则基本不变。此外，葡萄糖补充使0.9%丁醇下的生长抑制从92.7%降至48.8%。该结果表明大肠杆菌对2-6碳醇的膜响应机制具有保守性，维持OmpC水平可能成为提高酒精耐受性的工程靶点，为改造高产生物醇菌株提供了新思路。

创新点

1）系统揭示了E. coli对C2-C6醇的保守膜蛋白质组响应，包括能量代谢转运蛋白上调、非必需蛋白下调、肽聚糖降解酶上调、多数外膜β-桶蛋白下调；2）发现OmpC在多种醇胁迫下均显著降低，且该降低与LPS释放无关；3）提出维持OmpC水平是提高E. coli酒精耐受性的潜在策略。

研究对象（36）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli	PTS糖转运系统	ptnC	PtnC	转运	甘露糖特异性酶II复合物亚基，酒精胁迫下表达上调
Escherichia coli	PTS糖转运系统	ptnD	PtnD	转运	甘露糖特异性酶II复合物亚基，酒精胁迫下表达上调
Escherichia coli	PTS糖转运系统	ptkC	PtkC	转运	半乳糖醇特异性酶II复合物亚基，乙醇和丁醇下LFC>4.6
Escherichia coli	寡肽转运系统	oppC	OppC	转运	OppABCDF系统亚基，酒精胁迫下表达上调
Escherichia coli	寡肽转运系统	oppD	OppD	转运	OppABCDF系统亚基，酒精胁迫下表达上调
Escherichia coli	抗菌肽转运	sbmA	SbmA	转运	己醇下LFC≈3.71，丁醇下也显著增加
Escherichia coli	膜转运蛋白/质子动力维持	yghB	YghB	转运	推测参与维持质子动力，乙醇、丁醇、己醇下LFC>1.6
Escherichia coli	多药外排系统	mdtA	MdtA	转运	乙醇下LFC≈3.92，与TolC形成MdtABC-TolC外排泵
Escherichia coli	多药外排系统	mdtB	MdtB	转运	乙醇下LFC≈3.9，与丁醇耐受相关
Escherichia coli	多药外排系统	mdtC	MdtC	转运	乙醇和丁醇下LFC>2.9
Escherichia coli	多药外排系统	acrA	AcrA	转运	丁醇和己醇下LFC>2.3，己醇下LFC≈2.87
Escherichia coli	多药外排系统	acrB	AcrB	转运	丁醇和己醇下LFC>2.3
Escherichia coli	多药外排系统	acrD	AcrD	转运	乙醇和丁醇下LFC>2.5
Escherichia coli	多药外排系统	mdtE	MdtE	转运	三种醇下均显著下调，LFC在-6.09~-2.88之间
Escherichia coli	多药外排系统	mdtF	MdtF	转运	乙醇下LFC≈-5.35，丁醇下≈-3.62
Escherichia coli	电子传递链/呼吸链	mbhL	MbhL	能量供给	氢化酶1亚基，乙醇下LFC≈-5.91，己醇下≈-2.97
Escherichia coli	电子传递链/呼吸链	mbhS	MbhS	能量供给	氢化酶1亚基，己醇下显著下调
Escherichia coli	电子传递链/呼吸链	cybH	CybH	能量供给	氢化酶1亚基，酒精胁迫下LFC在-1.6~-5.91之间
Escherichia coli	电子传递链/呼吸链	appC	AppC	能量供给	细胞色素bd-II氧化酶亚基，乙醇下LFC≈-3.29，己醇下≈-1.64
Escherichia coli	肽聚糖降解/细胞伸长	mltA	MltA	催化	裂解性转糖基酶，三种醇下LFC>3.2，MRM验证丁醇下LFC~5
Escherichia coli	肽聚糖降解/细胞伸长	emtA	EmtA	催化	膜结合裂解性内转糖基酶，三种醇下LFC>2.6，MRM验证丁醇下LFC~4
Escherichia coli	肽聚糖降解/细胞伸长	mliC	MliC	催化	参与胞壁质再循环，三种醇下LFC>2，MRM验证丁醇下LFC~2.9
Escherichia coli	肽聚糖降解/细胞伸长	digH	DigH	催化	糖苷水解酶，可能有胞壁质酶活性，丁醇和己醇下LFC>2.8，MRM验证丁醇下LFC~5.1
Escherichia coli	外膜孔蛋白	ompC	OmpC	转运	主要外膜孔蛋白，酒精胁迫下显著降低，LFC≤-1.94，降至≤26%
Escherichia coli	外膜孔蛋白	ompF	OmpF	转运	乙醇下LFC≤-5.33，丁醇下≤-2.55，己醇下≤-1.97
Escherichia coli	外膜孔蛋白	ompA	OmpA	转运	酒精胁迫下蛋白水平变化不大
Escherichia coli	LPS转运/外膜生物合成	lptD	LptD	转运	LPS转运蛋白，乙醇和丁醇下降至≤14.8%，己醇下降至33.3%
Escherichia coli	脂肪酸转运	fadL	FadL	转运	长链脂肪酸外膜孔蛋白，LFC≤-2.26
Escherichia coli	麦芽糖转运	lamB	LamB	转运	麦芽糖孔蛋白，LFC≤-1.51
Escherichia coli	多药外排系统	tolC	TolC	转运	外膜外排通道，乙醇和丁醇下LFC≤-1.41，己醇下变化不显著
Escherichia coli	外膜蛋白组装	bamA	BamA	区室化	BAM复合物核心组分，乙醇和丁醇下LFC≤-1.58
Escherichia coli	维生素B12转运	btuB	BtuB	转运	维生素B12外膜受体，LFC≤-2.19
Escherichia coli	外膜蛋白酶	ompT	OmpT	催化	外膜蛋白酶，丁醇和己醇下LFC≤-1.97，乙醇下无显著变化
Escherichia coli	铁载体转运	fhuA	FhuA	转运	铁色素摄取受体，丁醇和己醇下LFC≤-1.5
Escherichia coli	LPS合成	wbbK	WbbK	催化	参与LPS合成，三种醇下LFC<-1.4
Escherichia coli	肠杆菌共同抗原(ECA)合成	wecF	WecF	催化	参与环状ECA合成，三种醇下LFC<-2

关键发现

葡萄糖补充显著提高MIC50：0.9%丁醇下，生长抑制从92.7%降至48.8%，MIC50从0.62%升至0.9%
2%丙醇时抑制从87%降至53%。共定量206个膜蛋白。乙醇/丁醇下PtkC LFC>4.6，己醇下SbmA LFC≈3.71
MdtA LFC≈3.92（乙醇），MdtB≈3.9（乙醇），AcrA≈2.87（己醇）。肽聚糖降解酶MltA LFC>3.2，DigH>2.8，EmtA>2.6，MliC>2
MRM验证丁醇下MltA LFC~5，DigH~5.1，EmtA~4，MliC~2.9。外膜β-桶蛋白普遍下调：OmpC降至≤26%（LFC≤-1.94），OmpF在乙醇下LFC≤-5.33，LptD在乙醇/丁醇下降至≤14.8%，MdtE LFC在-6.09~-2.88，MbhL乙醇下LFC≈-5.91。OmpC降低在多种E. coli菌株中均观察到，OmpA基本不变
EDTA释放LPS不降低OmpC，表明LPS释放不是OmpC降低原因。

研究结论

E. coli对2-6碳醇的膜蛋白质组响应是保守的，尽管酒精毒性随链长指数增加。OmpC在酒精胁迫下的下降普遍发生，且与LPS释放无关。维持外膜OmpC水平可能增强E. coli对多种酒精的耐受性，为工程改造高耐受生物醇生产菌株提供了靶点。