Quantification and mitigation of byproduct formation by low-glycerol-producing Saccharomyces cerevisiae strains containing Calvin-cycle enzymes
- 作者
- Aafke C. A. van Aalst, Mickel L. A. Jansen, Robert Mans, Jack T. Pronk
- 单位
- Department of Biotechnology, Delft University of Technology; DSM Biotechnology Centre
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels and Bioproducts（2023）
- DOI
- 10.1186/s13068-023-02329-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
量化并缓解表达卡尔文循环酶的酿酒酵母工程菌株在慢速生长条件下产生的乙醛和乙酸副产物，这些副产物源于 PRK/RuBisCO 旁路体内活性与生物合成 NADH 生成之间的不平衡。
研究策略
在慢速厌氧恒化培养中表征工程菌株，通过降低 RuBisCO 表达盒拷贝数、在 PRK C 端融合 19 氨基酸标签或 CLN2PEST 标签降低蛋白水平，以及使用生长速率依赖的 ANB1 启动子动态调控 PRK 表达，来降低副产物形成。
核心内容
本研究针对表达卡尔文循环酶（PRK/RuBisCO）的低甘油酿酒酵母工程菌株，在慢速生长条件下产生大量乙醛和乙酸副产物的问题开展系统表征与改造。作者在D=0.05 h⁻¹的慢速厌氧恒化培养中发现，工程菌株IMX1489较参考菌株乙醛产量高达80倍、乙酸产量高30倍，且乙醛浓度最高达6.5 mM，落入毒性范围，副产物积累源于PRK/RuBisCO旁路体内过容量与生物合成NADH生成之间的失衡。为缓解该问题，研究采用三种策略：将RuBisCO编码基因cbbM拷贝数从15降至2，使乙醛和乙酸产量分别降低67%和29%；额外在PRK C端融合19氨基酸标签使PRK蛋白水平降低13倍，乙醛和乙酸产量进一步降低94%和61%；利用生长速率依赖的ANB1启动子动态调控PRK表达，在0.05 h⁻¹下分别使乙醛和乙酸产量降低79%和40%，且不影响甘油产量。改造后菌株最大生长速率与参考菌株相当，甘油产量降低72%，在慢速恒化培养中甘油/生物量仅为参考菌株的3.5%。该工作定量揭示了副产物形成的容量依赖机制，并证明生长速率响应启动子可有效解偶联生长与副产物积累，为工业发酵过程中动态调控基因表达提供了可行方案。
创新点
量化了低生长速率下 PRK/RuBisCO 旁路菌株的乙醛和乙酸生成；发现副产物源于旁路体内过容量；开发了通过 C 端标签和生长速率依赖启动子动态调节蛋白水平的新策略。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 | 甘油合成 | GPD2 | Gpd2p | 催化 | NAD+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶同工酶，基因敲除以减少甘油生成 |
| 酿酒酵母 | 卡尔文循环/非氧化戊糖磷酸途径 | prk | PRK | 催化 | 来自菠菜的磷酸核酮糖激酶，催化核酮糖-5-磷酸磷酸化为核酮糖-1,5-二磷酸 |
| 酿酒酵母 | 卡尔文循环 | cbbM | RuBisCO (CbbM) | 催化 | 细菌核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶，催化 CO2 固定生成 3-磷酸甘油酸 |
| 酿酒酵母 | 非氧化戊糖磷酸途径 | RPE1, TKL1, TAL1, NQM1, RKI1, TKL2 | 核酮糖-5-磷酸异构酶、转酮醇酶、转醛醇酶等 | 催化 | 过表达以增加核酮糖-5-磷酸供应 |
| 酿酒酵母 | 基因表达调控 | ANB1 启动子 | 无 | 调控 | 转录水平与生长速率正相关，用于驱动 prk 表达实现动态调控 |
| 酿酒酵母 | 基因表达调控 | DAN1 启动子 | 无 | 调控 | 厌氧诱导启动子，用于防止好氧预培养中 PRK 毒性 |
| 酿酒酵母 | 乙醛代谢 | ALD4, ALD5, ALD6 | 乙醛脱氢酶 | 催化 | 将乙醛氧化为乙酸 |
| 酿酒酵母 | 蛋白标签/降解 | prk-19aa 或 prk-CLN2PEST | PRK 融合蛋白 | 调控 | C 端 19 氨基酸标签或 CLN2PEST 标签降低 PRK 蛋白水平，19aa 标签使 PRK 蛋白降低 13 倍 |
关键发现
- 在 D=0.05 h^-1 的慢速厌氧恒化培养中，PRK/RuBisCO 菌株(IMX1489)较参考菌株乙醛产量高 80 倍、乙酸产量高 30 倍。将 RuBisCO 编码基因 cbbm 拷贝数从 15 降到 2，乙醛和乙酸产量分别降低 67% 和 29%；额外融合 19aa C 端标签使 PRK 蛋白水平降低 13 倍，乙醛和乙酸产量进一步降低 94% 和 61%。使用 ANB1 启动子控制 PRK 合成可在
- 05 h^-1 下分别使乙醛和乙酸产量降低 79% 和 40%，且不影响甘油产量。该菌株最大生长速率与参考菌株相当，甘油产量低 72%。此外，IMX1489 在
- 05 h^-1 下甘油/生物量仅为参考菌株的
- 5%，乙醇产量仅高
- 0%；在快速批次培养中，甘油/生物量比 15×cbbm 菌株高
- 6 倍，但较参考菌株低 72%。乙醛浓度最高达
- 5 mM，处于毒性范围。
研究结论
乙醛和乙酸副产物形成由 PRK 和 RuBisCO 的体内过容量引起，降低其容量可有效缓解副产物形成；生长速率依赖的 ANB1 启动子调控 PRK 表达显示出在工业批次过程中动态调节基因表达的潜力。