Functional mining of novel terpene synthases from metagenomes
- 作者
- Suryang Kwak, Nathan Crook, Aki Yoneda, Naomi Ahn, Jie Ning, Jiye Cheng, Gautam Dantas
- 单位
- The Edison Family Center for Genome Sciences & Systems Biology, Washington University School of Medicine in St. Louis; Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine in St. Louis; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University; Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis; Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine in St. Louis
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2022）
- DOI
- 10.1186/s13068-022-02189-9
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统的基于序列相似性的方法难以预测细菌来源的萜烯合酶，缺乏从宏基因组中无序列依赖地挖掘新型萜烯合酶的有效筛选体系。
研究策略
利用萜烯生物合成前体（异戊烯基焦磷酸）过量积累对大肠杆菌宿主的毒性作为筛选压力，构建基于前体毒性的功能宏基因组筛选系统。通过优化宿主菌株（LowMut）和筛选流程（二次筛选）减少自发突变导致的假阳性，从人类粪便宏基因组文库中筛选新型萜烯合酶，并在大肠杆菌和酿酒酵母中进行功能验证与产物合成。
核心内容
针对传统序列相似性方法难以挖掘细菌萜烯合酶的问题，该研究利用萜烯前体异戊烯基焦磷酸过量积累对大肠杆菌的毒性作为筛选压力，构建了无序列依赖的功能宏基因组筛选系统。通过采用基因组精简、低突变率的LowMut宿主并优化二次筛选流程，显著降低了自发突变导致的假阳性（14/24个DH10B阴性克隆发生转座插入突变）。从人粪便宏基因组文库中筛选到10个候选萜烯合酶基因，其中TS10F1与已知β-法尼烯合酶无序列同源性，体外实验证实其以FPP为底物生成β-法尼烯。将TS10F1在酿酒酵母中异源表达后，从葡萄糖发酵生产β-法尼烯的最高产量达119.74±2.85 mg/L，而对照菌株无产物检出。该工作建立了基于前体毒性的宏基因组功能筛选平台，证明了其发现全新序列萜烯合酶的潜力，为萜类化合物的微生物合成提供了新酶资源。
创新点
1. 首次将基于前体毒性的筛选方法扩展到宏基因组文库，实现无序列依赖的萜烯合酶挖掘；2. 采用基因组精简、低突变率的LowMut大肠杆菌宿主，显著降低自发突变引起的假阳性；3. 发现一个与已知β-法尼烯合酶无氨基酸序列相似性的新型β-法尼烯合酶TS10F1，并实现其在酿酒酵母中的异源表达和β-法尼烯生产。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲羟戊酸(MVA)途径（异源） | ERG12, ERG8, MVD1, idi, ispA | 甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯基焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | MBIS操纵子，在IPTG诱导下过量合成异戊烯基焦磷酸前体，产生毒性筛选压力 |
| Escherichia coli (LowMut) | 萜烯生物合成 | TS10F1 | β-法尼烯合酶 | 催化 | 从人粪便宏基因组文库中筛选到的新型萜烯合酶，与已知β-法尼烯合酶无序列相似性，催化FPP脱磷酸生成β-法尼烯 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | ERG10, tHMG1 | 乙酰-CoA C-乙酰转移酶、截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达以增强MVA通量，提高FPP供应 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 能量供给 | 过表达将糖酵解通量导向磷酸戊糖途径，再生NADPH，为MVA途径提供还原力 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | ERG9 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 下调ERG9以减少FPP向甾醇合成的消耗，提高β-法尼烯前体可用性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | TS10F1 | β-法尼烯合酶 | 催化 | 密码子优化后整合表达，利用FPP合成β-法尼烯，实现从葡萄糖生产 |
| Escherichia coli | 萜烯生物合成 | AgBis, MsLim | 红没药烯合酶、柠檬烯合酶 | 催化 | 作为阳性对照，验证前体毒性筛选系统对倍半萜合酶和单萜合酶的回收能力 |
关键发现
- 优化的筛选体系在8 mM甲羟戊酸和0.5 mM IPTG条件下，阳性对照与阴性对照的生长差异最大
- LowMut菌株在8 mM甲羟戊酸平板上阴性对照存活率显著低于DH10B，且14/24个DH10B阴性克隆的MBIS操纵子发生转座插入突变。从人粪便宏基因组文库中筛选到10个独特萜烯合酶候选基因，其中TS10F1可成功克隆并表征，其与Prevotella pectinovora的组氨酸磷酸酶家族蛋白有75%氨基酸同一性，体外酶学实验证实TS10F1以FPP为底物生成β-法尼烯（EC 4.2.3.47），分子量约21.54 kDa。在酿酒酵母SHE_TS10F1菌株中，从葡萄糖发酵生产β-法尼烯，最高产量为119.74±2.85 mg/L（165小时），产率为3.89±0.19 mg/g葡萄糖（95小时），生产力为0.721 g/L·h
- 出发菌株SHE_Empty未检测到β-法尼烯。
研究结论
建立了基于前体毒性的功能宏基因组筛选方法，可从环境宏基因组（如人肠道菌群）中高效挖掘新型萜烯合酶，并证明了该方法在发现与已知酶无序列相似性的功能酶方面的潜力。工程化酿酒酵母表达筛选到的TS10F1可实现β-法尼烯的糖基发酵生产，为萜烯类化合物的微生物合成提供了新酶资源和筛选平台。