高级醇 · 代谢工程文献库

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Understanding the competing pathways leading to hydropyrene and isoelisabethatriene

作者
Shani Zev, Marion Ringel, Ronja Driller, Bernhard Loll, Thomas Brück, Dan T. Major
单位
Department of Chemistry and Institute for Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University; Werner Siemens Chair of Synthetic Biotechnology, Department of Chemistry, Technical University of Munich; Institute for Chemistry and Biochemistry, Structural Biochemistry Laboratory, Freie Universität Berlin; Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, Danish Research Institute of Translational Neuroscience - DANDRITE
杂志
Beilstein Journal of Organic Chemistry（2022）
DOI
10.3762/bjoc.18.97
所属领域
合成生物学
关键词
diterpenesenzyme mechanismquantum mechanicsterpene synthasesthermodynamic and kinetic control
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解决的核心问题

理解hydropyrene synthase中hydropyrene和isoelisabethatriene竞争性产物生成途径的热力学与动力学机制，以及M75L突变如何改变产物分布。

研究策略

采用量子化学计算（DFT，M06-2X/6-31G+(d,p)）在气相中研究HP和IE两条反应路径的自由能面，结合构象搜索与过渡态分析。

研究路线图

100%
研究问题：HP与IE竞争性产物生成机制及M75L突变效应
策略：量子化学计算（M06-2X/6-31G+(d,p)）研究两条反应路径自由能面
关键改造：构象搜索与过渡态分析揭示路径分歧结构因素
关键结果1：HP途径热力学优势（ΔG=-62.8 kcal/mol）
关键结果2：IE途径动力学控制（C*→D*无势垒，放能-35.9）
关键结果3：C*双键-阳离子距离2.0Å vs C中3.5Å
结论：IE产物动力学控制，M75L突变改变底物折叠方式
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核心内容

该研究通过密度泛函理论计算，系统解析了hydropyrene synthase（HpS）催化生成hydropyrene（HP）与isoelisabethatriene（IE）两条竞争性产物的热力学与动力学机制。计算结果显示，HP途径总放能达-62.8 kcal/mol，远优于IE途径的-34.4 kcal/mol，表明热力学上HP占据绝对优势。然而，两条途径在C1-C10环化后的1,3-氢化物转移步骤存在显著差异：IE途径的能垒仅5.4 kcal/mol，远低于HP途径的16.2 kcal/mol，且其后续C*→D*步骤无势垒放能-35.9 kcal/mol，说明IE产物实际由动力学控制生成。关键结构差异在于C*中间体中双键与阳离子的距离为2.0 Å，而HP途径为3.5 Å，这直接决定了后续质子转移与环化路径的分歧。对M75L突变体的计算与实验对照表明，该突变使IE A从野生型中的13%升至44%成为主要产物，推测源于活性位点空间结构改变影响了底物折叠方式。该研究首次从理论层面阐明HP与IE途径的分支机制，为理解二萜合酶产物多样性的结构基础提供了新的分子层面解释。

创新点

首次从理论层面揭示HP与IE途径分歧的关键结构因素（C*中双键与阳离子距离2.0 Å vs C中3.5 Å），提出IE产物由动力学控制而非热力学控制，并解释M75L突变效应的可能来源。

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Streptomyces clavuligerus 二萜生物合成 — Hydropyrene synthase (HpS) 催化 野生型HpS生成hydropyrene (52%)、hydropyrenol (26%)、isoelisabethatriene A (13%)和B (9%)
Streptomyces clavuligerus 二萜生物合成 — HpS M75L突变体 催化 单点突变M75L使isoelisabethatriene A成为主要产物（44%）

关键发现

  1. HP途径总放能-62.8 kcal/mol，IE途径总放能-34.4和-35.9 kcal/mol
  2. HP途径C1-C10环化中间体B比A稳定-11.4 kcal/mol，1,3-氢化物转移能垒16.2 kcal/mol
  3. IE途径C1-C10环化中间体B*比A*稳定-15.7 kcal/mol，1,3-氢化物转移能垒仅5.4 kcal/mol
  4. IE途径C*→D*无势垒且放能-35.9 kcal/mol，1,2-氢迁移能垒6.6 kcal/mol
  5. C*中双键与阳离子距离为2.0 Å，C中为3.5 Å
  6. 野生型HpS产物组成为HP 52%、HPol 26%、IE A 13%、IE B 9%，M75L突变体使IE A成为主要产物（44%）。

研究结论

HP途径在热力学上远优于IE途径，因此IE产物的生成主要受动力学控制；IE A和IE B之间能垒低，可能处于平衡，其相对比例由活性位点碱基接近性决定；HP与IE途径之间不存在热力学平衡，但GGDP与LGDP之间可能存在平衡，产物分布差异主要源于底物在活性位点的不同折叠方式。