Analysis of the Growth and Metabolites of a Pyruvate Dehydrogenase Complex- Deficient Klebsiella pneumoniae Mutant in a Glycerol-Based Medium
- 作者
- Danfeng Xu, Zongxiao Jia, Lijuan Zhang, Shuilin Fu, Heng Gong
- 单位
- State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, P.R. China
- 杂志
- Journal of Microbiology and Biotechnology（2018）
- DOI
- 10.4014/jmb.1801.01045
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
确定丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）在肺炎克雷伯氏菌以甘油为碳源生长和代谢中的作用，特别是其在厌氧条件下的关键功能，并探讨其对1,3-丙二醇生产的影响。
研究策略
通过基因敲除构建PDHC缺陷突变体（KG-PD）、PFL缺陷突变体（KG-PF）及PDHC与FdnGHI双缺陷突变体（KG-PDN），在有氧和厌氧条件下比较生长、代谢产物积累、酶活性和细胞内氧化还原状态（NADH/NAD+），结合CO2补充实验分析PDHC的生理功能。
核心内容
该研究通过基因敲除构建了肺炎克雷伯氏菌丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）缺陷突变体KG-PD、丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）缺陷突变体KG-PF以及PDHC与甲酸脱氢酶N（FdnGHI）双缺陷突变体KG-PDN，在有氧和厌氧条件下系统比较了各菌株的生长、代谢产物积累、酶活性和胞内NADH/NAD+比值，并结合CO2补充实验阐明PDHC的生理功能。结果显示，有氧条件下PDHC活性（1.20 U/mg）约为PFL的4倍，阻断PDHC导致严重生长缺陷（细胞浓度仅为亲本的23%），丙酮酸积累至3.98 g/L；厌氧条件下阻断PDHC比阻断PFL造成更严重的生长抑制，KG-PD厌氧细胞浓度为亲本的68%，NADH/NAD+比值降至亲本的35%，且添加NaHCO3不能恢复其生长，说明厌氧条件下PDHC的关键作用是为细胞提供NADH以维持氧化还原平衡而非补充CO2。KG-PDN在有氧条件下生长几乎完全恢复并积累乙偶姻9.51 g/L和3-羟基丙酸3.57 g/L。此外，PFL缺陷突变体虽存在厌氧生长缺陷，但其厌氧1,3-丙二醇产量最高达20.3 g/L（亲本为18.5 g/L），提示通过改善该菌株碳通量有望构建高产1,3-丙二醇菌株。研究揭示了PDHC在肺炎克雷伯氏菌甘油代谢中与大肠杆菌不同的独特功能，并为乙偶姻及1,3-丙二醇的高效生产提供了新策略。
创新点
首次揭示在厌氧条件下肺炎克雷伯氏菌PDHC的关键作用是为细胞提供NAH以维持氧化还原平衡，而非如大肠杆菌那样提供CO2；发现PFL缺陷突变体中1,3-丙二醇产量提高，提出通过改善其碳通量构建高产菌株的策略；构建的FdnGHI/PDHC双缺陷突变体在有氧条件下意外恢复生长并积累高价值产物乙偶姻和3-羟基丙酸。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella pneumoniae KG2 | 1,3-丙二醇合成 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 亲本菌株，敲除ldhA以消除乳酸合成，提高1,3-丙二醇产量 |
| Klebsiella pneumoniae KG-PD | 丙酮酸代谢 | aceE, aceF, lpdA | 丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC） | 催化 | PDHC缺陷突变体，有氧和厌氧生长均受抑制，厌氧下NADH/NAD+降低 |
| Klebsiella pneumoniae KG-PF | 丙酮酸代谢 | pflA, pflB | 丙酮酸甲酸裂解酶（PFL） | 催化 | PFL缺陷突变体，厌氧生长缺陷但1,3-丙二醇产量最高 |
| Klebsiella pneumoniae KG-PDN | 甲酸代谢 | fdnG, fdnH, fdnI | 甲酸脱氢酶N（FdnGHI） | 催化 | PDHC和FdnGHI双缺陷突变体，有氧生长恢复并积累乙偶姻和3-羟基丙酸 |
| Klebsiella pneumoniae KG-PD | 丙酮酸代谢 | poxB | 丙酮酸氧化酶 | 催化 | 推测在PDHC缺陷突变体中PoxB途径增强以提供CO2 |
关键发现
- 有氧条件下，亲本菌株KG2的PDHC活性为1.20 U/mg，约为PFL的4倍
- 阻断PDHC导致严重生长缺陷，细胞浓度降至2.31 g/L（仅为亲本的23%），丙酮酸积累至3.98 g/L。厌氧条件下，PFL活性（0.81 U/mg）约为PDHC的2倍，但阻断PDHC比阻断PFL造成更严重的生长抑制，KG-PD厌氧细胞浓度为4.21 g/L（为亲本的68%），且NADH/NAD+比值降至0.09（仅为亲本的35%）。添加NaHCO3不能恢复KG-PD的厌氧生长，而进一步阻断FdnGHI（KG-PDN）使厌氧细胞浓度从3.89降至3.21 g/L，但添加NaHCO3可恢复至KG-PD水平。KG-PDN在有氧条件下生长几乎完全恢复（细胞浓度9.93 g/L），同时积累乙偶姻9.51 g/L和3-HP 3.57 g/L。亲本KG2有氧和厌氧1,3-丙二醇产量分别为10.2和18.5 g/L
- PFL缺陷突变体KG-PF厌氧1,3-丙二醇产量最高达20.3 g/L，但乙醇降至0.61 g/L。KG-PDN厌氧乙酸产量为2.34 g/L。
研究结论
肺炎克雷伯氏菌在有氧条件下主要通过PDHC介导丙酮酸向乙酰CoA的转化；厌氧条件下PDHC的关键作用是为细胞提供NADH以维持氧化还原平衡，而非提供CO2。PFL缺陷突变体虽存在厌氧生长缺陷，但1,3-丙二醇产量最高，通过改善其碳通量可望构建高产1,3-丙二醇菌株。FdnGHI/PDHC双缺陷突变体具有生产乙偶姻的潜力。