Prospects of thermotolerant Kluyveromyces marxianus for high solids ethanol fermentation of lignocellulosic biomass
- 作者
- Priya Sengupta, Ramya Mohan, Ian Wheeldon, David Kisailus, Charles E. Wyman, Charles M. Cai
- 单位
- Bourns College of Engineering, University of California Riverside (UCR); Center for Environmental Research and Technology (CE-CERT), Bourns College of Engineering, University of California Riverside (UCR); Department of Materials Science and Engineering, University of California at Irvine
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2022）
- DOI
- 10.1186/s13068-022-02232-9
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
高固含木质纤维素SSF过程中，真菌纤维素酶最适温度（50-60°C）与常用酿酒酵母耐温上限（约37°C）不匹配，导致SSF在低于酶最适温度下运行，酶活性降低。需要开发耐热发酵菌株以接近酶最适温度运行SSF，提升乙醇产率和产量。
研究策略
将耐热马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus CBS 6556与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae D5A对比，在CELF预处理杨木的高固含（13-20 wt%不溶固形物）SSF中评估两者在37°C和43°C下的生长、乙醇生产、代谢物积累及细胞形态，结合SEM成像和甘油等代谢物分析探究发酵停滞的机制。
核心内容
本研究系统评估了耐热马克斯克鲁维酵母CBS 6556与酿酒酵母D5A在CELF预处理杨木高固含同步糖化发酵（SSF）中的性能差异。在纯糖发酵中，CBS 6556于37°C下在50和150 g/L葡萄糖中的生长速率分别达0.7938和0.6705 h⁻¹，为D5A的1.7倍和5倍，且在43°C下仍保持生长而D5A完全停滞。然而在高固含SSF中，尽管CBS 6556在43°C下表现出最高的初始乙醇生产率，其发酵在早期即陷入停滞，5天理论乙醇产率仅约63%，且随固含增加，最终乙醇浓度较37°C时下降4.3%至21%。结合扫描电镜观察、细胞体积测量（43°C下缩小约64%）及甘油产量分析（较D5A高约50%），揭示了高温与乙醇联合胁迫对CBS 6556细胞膜造成不可逆损伤是发酵早停的根本原因。该发现明确了马克斯克鲁维酵母在高固含SSF中的潜力与瓶颈，指出通过膜工程提升其乙醇耐受性，有望将SSF有效发酵时间缩短至D5A所需的一半，为开发下一代工业乙醇菌株指明了改造方向。
创新点
首次将CBS 6556应用于CELF预处理杨木的高固含SSF并系统对比D5A；在43°C近糖化温度下验证其耐热潜力；揭示CBS 6556细胞膜在乙醇与高温联合胁迫下损伤导致早期发酵停滞，为后续膜工程改造提供方向。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Kluyveromyces marxianus CBS 6556 | 乙醇发酵 | — | — | 催化 | 耐热酵母菌株，在43°C下可发酵葡萄糖产乙醇，用于高固含SSF |
| Saccharomyces cerevisiae D5A | 乙醇发酵 | — | — | 催化 | 对照酿酒酵母菌株，常用于SSF，37°C下表现稳定 |
| — | 纤维素糖化 | — | Cellic® Ctec2 纤维素酶复合物 | 催化 | 商业纤维素酶制剂，SSF中用量15 mg蛋白/g葡聚糖 |
关键发现
- 在37°C下，CBS 6556在50和150 g/L葡萄糖中的生长速率分别为0.7938和0.6705 h^-1，分别是D5A（0.4759和0.1318 h^-1）的1.7倍和5倍
- 43°C时CBS 6556仍在50和150 g/L葡萄糖中保持0.701和0.345 h^-1生长速率，而D5A不生长。纯糖发酵中，两菌在37°C下对150、180、200 g/L葡萄糖均可发酵，乙醇耐受极限约80 g/L。高固含SSF中，CBS 6556在43°C下11和15 wt%葡聚糖负荷时初始乙醇生产率最高，但5天理论乙醇产率约63%且早期停滞
- CBS 6556在43°C下的最终乙醇浓度比37°C时分别低4.3%、15.7%和21%（随固含增加）。18 wt%葡聚糖负荷SSF中，CBS 6556在37°C下前3天与D5A产乙醇速率相近，之后停止
- CBS 6556在37°C下甘油产量比D5A高约50%，在43°C、150 g/L葡萄糖中细胞体积缩小约64%。SEM显示CBS 6556在43°C下细胞严重皱缩。
研究结论
K. marxianus CBS 6556具有高生长速率、快速葡萄糖消耗和初始乙醇生产能力，在37°C和43°C均表现出优于D5A的早期发酵性能，但其细胞膜对乙醇-高温联合胁迫敏感，导致过早发酵停滞和最终乙醇产率低于D5A。通过膜工程提高其乙醇耐受性（如能在43°C下耐受>10% w/v乙醇并保持0.125 g乙醇/g初始葡聚糖/天的初始生产率），可将SSF有效发酵时间缩短至D5A达到90%乙醇产率所需时间的一半，是极具潜力的下一代工业乙醇生产菌株。