Directed evolution and secretory expression of xylose isomerase for improved utilisation of xylose in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Jung-Hoon Bae, Mi-Jin Kim, Bong Hyun Sung, Yong-Su Jin, Jung-Hoon Sohn
- 单位
- Synthetic Biology and Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB); Department of Food Science and Human Nutrition, University of Illinois at Urbana-Champaign; Cellapy Bio Inc.
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2021）
- DOI
- 10.1186/s13068-021-02073-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母在葡萄糖存在时对木糖利用效率低，胞内木糖异构酶受木糖醇抑制且木糖摄取速率低，需要实现木糖在摄取前转化为木酮糖以提高混合糖共发酵效率。
研究策略
通过定向进化将Piromyces sp. E2木糖异构酶的最适pH从7.0调至5.0以适应酵母发酵酸性条件；利用翻译融合伴侣（TFP3）实现木糖异构酶的高效分泌，将木糖在胞外转化为木酮糖，再被酵母摄取利用。
核心内容
针对酿酒酵母在葡萄糖存在下木糖利用效率低、胞内木糖异构酶受抑制且木糖摄取慢的问题，本研究通过定向进化将Piromyces sp. E2来源的木糖异构酶最适pH从7.0调至5.0以适应酵母发酵的酸性环境，获得XI-76双突变体（E56A, I252M），其在pH 5下比活性比野生型高2倍。随后利用翻译融合伴侣TFP3实现该酶在酿酒酵母中的高效分泌，使木糖在胞外即转化为木酮糖再被细胞摄取，分泌量达MFA信号肽的2倍。分泌XI-76使SR8菌株在木糖发酵中木糖消耗和乙醇产量分别提高约7–20%和15–20%，葡萄糖/木糖共发酵时木糖消耗提高约7%、乙醇产量提高约15%，最终乙醇产率达0.41 g/g，木糖醇产率仅0.1 g/g木糖。添加0.5 mM MnCl2和20 mM MgCl2可进一步提升生长约30%。该策略通过在摄取前将木糖异构化为木酮糖，有效缓解了木糖摄取瓶颈，为木质纤维素C5/C6糖同步发酵提供了新思路。
创新点
首次实现低pH优化的木糖异构酶在酿酒酵母中的超分泌表达；采用TFP3融合伴侣实现胞外木糖异构酶分泌；通过胞外转化木糖为木酮糖的策略改善葡萄糖/木糖共发酵。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae 2805Δgal80 | 木糖异构酶途径 | xylA | 木糖异构酶（XI） | 催化 | 来自Piromyces sp. E2，经密码子优化，用于胞外木糖转化为木酮糖 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径 | XYL1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | SR8菌株含有XYL1、XYL2、XYL3，并敲除PHO13和ALD6 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径 | XYL2 | 木糖醇脱氢酶（XDH） | 催化 | 依赖NAD+，将木糖醇转化为木酮糖 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 木糖代谢下游途径 | XYL3 | 木酮糖激酶（XK） | 催化 | 编码木酮糖激酶，磷酸化木酮糖进入磷酸戊糖途径 |
| Saccharomyces cerevisiae 2805Δgal80 | 蛋白分泌途径 | CIS3 | CIS3（PIR4） | 转运 | TFP3为CIS3蛋白N端117个氨基酸，作为翻译融合伴侣促进木糖异构酶分泌 |
| Saccharomyces cerevisiae 2805Δgal80 | 木糖异构酶途径 | xylA (XI-76) | 木糖异构酶突变体XI-76 | 催化 | 含E56A和I252M双突变，最适pH由7.0降至5.0 |
| Saccharomyces cerevisiae 2805Δgal80 | 木糖异构酶途径 | xylA (XI-E56A) | 木糖异构酶突变体XI-E56A | 催化 | 单突变E56A，最适pH为6.0 |
| Saccharomyces cerevisiae 2805Δgal80 | 木糖异构酶途径 | xylA (XI-I252M) | 木糖异构酶突变体XI-I252M | 催化 | 单突变I252M，最适pH仍为7.0 |
| Saccharomyces cerevisiae 2805Δgal80, XKS1 | 木糖代谢下游途径 | XKS1 | 木酮糖激酶 | 催化 | 多拷贝整合XKS1，用于验证木酮糖利用 |
关键发现
- 定向进化获得XI-76双突变体（E56A, I252M），其最适pH从7.0降至5.0
- 在pH 5条件下XI-76比活性比野生型高2倍，最大活性比野生型在pH 7时高20%
- 分泌XI-76使SR8菌株在木糖发酵中木糖消耗和乙醇产量分别提高约7-20%和15-20%
- 葡萄糖/木糖共发酵时木糖消耗提高约7%，乙醇产量提高约15%
- 共发酵最终乙醇产率为0.41 g/g，木糖醇产率为0.1 g/g木糖
- TFP3分泌的木糖异构酶量是MFA信号肽的2倍
- 添加0.5 mM MnCl2和20 mM MgCl2可使生长进一步提高约30%。
研究结论
在酵母摄取木糖之前利用分泌型低pH优化木糖异构酶将木糖异构化为木酮糖，可有效改善木糖发酵及葡萄糖/木糖共发酵，为木质纤维素C5/C6糖同步利用提供了新策略。