植物糖転移酵素を用いた機能性化合物の糖鎖構築
- 作者
- Hajime Mizukami
- 单位
- Department of Pharmacognosy, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Nagoya City University, 3-1 Tanabe-dori, Mizuho-ku, Nagoya 467-8603, Japan; Kochi Prefectural Makino Botanical Garden, 4200-6 Godaisan, Kochi 781-8125, Japan
- 杂志
- Yakugaku Zasshi（2017）
- DOI
- 10.1248/yakushi.15-00108
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
天然功能性化合物（如姜黄素、槲皮素等）大多水溶性差、口服吸收低，而化学法合成糖苷步骤繁琐、选择性差；如何利用植物糖基转移酶高效、特异性地构建其糖链并解析关键酶的功能，是该领域的核心问题。
研究策略
以长春花培养细胞进行生物转化并克隆PSPG；在大肠杆菌中表达重组酶并筛选活性；构建蔗糖合酶/UDP-葡萄糖原位再生的一锅双酶体系；利用同源克隆、VIGS基因沉默、定点突变、同源建模及大鼠药代动力学等手段解析糖基转移酶功能与糖链结构-吸收关系。
核心内容
本研究系统考察了植物糖基转移酶在功能性化合物糖链构建中的应用。以长春花培养细胞为生物转化体系，将水溶性极差的姜黄素（3.0×10⁻⁵ μmol/mL）转化为系列糖苷，其中CG5水溶性提升约2.2×10⁷倍，但抗氧化活性随糖链延长而丧失。在大肠杆菌中重组表达了多种PSPG，鉴定出CaUGT2催化姜黄素生成单、二糖苷，CaUGT3负责糖链延伸；通过构建AtSUS1/蔗糖偶联的UDP-葡萄糖原位再生一锅双酶体系，60分钟内姜黄素几乎100%转化为CG3，而对照组仅约30%。同源建模和定点突变揭示CaUGT3底物口袋中His125/Asn206残基决定其延伸活性。此外，VIGS沉默CrUGT8显著降低长春花碱和文多灵含量，且其催化效率远高于CrUGT7。大鼠口服试验表明糖链结构决定吸收效率：异槲皮苷等可被小肠糖苷酶水解的配糖体生物利用度达12%–35%，而芦丁仅0.8%。研究证明植物PSPG是构建功能性糖苷的高效工具，且糖苷的口服吸收取决于其能否被小肠酶水解释放苷元。
创新点
建立了AtSUS1/蔗糖偶联的UDP-葡萄糖再循环一锅双酶系统；从长春花、栀子中克隆并鉴定了多个参与姜黄素、环烯醚萜/马钱素、藏红花素生物合成的PSPG；首次以同源建模和定点突变揭示糖链延伸酶CaUGT3的底物口袋扩大机制；通过酶法合成系列槲皮素糖苷系统证明了小肠糖苷酶可水解性决定口服吸收效率。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 长春花悬浮培养细胞 | 姜黄素糖苷化 | — | 内源PSPG | 催化 | 将姜黄素转化为CG1-CG5，糖苷总产量约2.5 μmol/g鲜细胞；甲基茉莉酸可提高活性。 |
| 大肠杆菌（重组表达） | 姜黄素糖苷化 | CaUGT2 (UGT73A15) | CaUGT2 | 催化 | 对姜黄素两个酚羟基进行葡萄糖基化，生成CG1和CG3。 |
| 大肠杆菌（重组表达） | 姜黄素/黄酮O-糖苷糖链延伸 | CaUGT3 (UGT94E3) | CaUGT3 | 催化 | 以CG1为底物进行1,6-葡萄糖基延伸生成CG2，并可继续生成CG6/CG7；也作用于槲皮素3-O-葡萄糖苷等。 |
| 大肠杆菌（重组表达） | UDP-葡萄糖再生/糖苷合成 | AtSUS1 | 蔗糖合酶1（AtSUS1） | 能量供给 | 利用蔗糖再生UDP-葡萄糖并清除UDP，用于一锅双酶配糖化体系。 |
| 大肠杆菌（重组表达） | 黄酮醇糖苷化 | UGT71C3 | UGT71C3 | 催化 | 单独表现为flavonol 3-O-葡萄糖基转移酶；与AtSUS1共存时还生成QG2/QG3。 |
| 长春花叶片（VIGS）及大肠杆菌 | 环烯醚萜/马钱素/单萜吲哚生物碱（MIA）生合成 | CrUGT8 (UGT709C2) | CrUGT8 | 催化 | 催化7-deoxyloganetic acid→7-deoxyloganic acid；VIGS沉默后MIA含量显著下降。 |
| 大肠杆菌（重组表达） | 环烯醚萜/MIA生物合成 | CrUGT6 (UGT85A23) | CrUGT6 | 催化 | 催化7-deoxyloganetin→7-deoxyloganin；对7-deoxyloganetin的Km=0.142 mM，kcat=0.0115 s^-1。 |
| 大肠杆菌（重组表达） | 环烯醚萜/MIA生物合成 | CrUGT7 (UGT76A2) | CrUGT7 | 催化 | 催化7-deoxyloganetin→7-deoxyloganin；对7-deoxyloganetin Km=2.12 mM，kcat=0.00520 s^-1；催化效率低于CrUGT8。 |
| 大肠杆菌（重组表达） | 藏红花素（crocin）生物合成 | GjUGT1/GjUGT14 (UGT75L6) | GjUGT1/GjUGT14 | 催化 | 催化藏红花酸（crocetin）羧基依次糖基化生成crocin-5和crocin-4；两个蛋白仅差3个氨基酸。 |
| 大肠杆菌（重组表达） | 藏红花素生物合成/糖链延伸 | GjUGT9 (UGT94E5) | GjUGT9 | 催化 | 藏红花酸葡萄糖酯1,6-葡萄糖基转移酶，催化crocin-5→crocin-4及crocin-3→crocin-2→crocin-1。 |
| 大肠杆菌（重组表达） | 糖链延伸酶结构与功能 | CaUGT3定点突变体（His125Phe, Asn206Phe等） | CaUGT3突变体 | 催化 | His125Phe使kcat/Km由573降至1.07 M^-1 s^-1，证实His125对底物口袋空间的关键作用。 |
关键发现
- 长春花培养细胞可将姜黄素转化为CG1-CG5糖苷
- 水溶性从姜黄素的3.0×10^-5 μmol/mL提高到CG1的7.0×10^-3（2.3×10^2倍）、CG2的7.3×10^1（2.4×10^6倍）、CG3的3.7×10^2（1.2×10^7倍）、CG5的6.5×10^2（2.2×10^7倍）
- 单葡萄糖苷抗氧化活性降至约50%，二葡萄糖苷活性消失。② 重组CaUGT2催化姜黄素生成CG1和CG3，CaUGT3催化CG1的1,6-糖链延伸生成CG2并可继续生成CG6/CG7。③ 加入AtSUS1/sucrose进行UDP-葡萄糖原位再循环后，60 min内姜黄素约100%转化为CG3
- 无AtSUS1时仅约30%生成CG3、约20%底物残留
- 该系统还使UGT71C3额外生成槲皮素3,4'-二葡萄糖苷和3,7-二葡萄糖苷。④ CrUGT8对7-deoxyloganetic acid的Km=87.7 μM、kcat=0.131 s^-1、kcat/Km=1484.1 M^-1 s^-1
- CrUGT7对应kcat/Km仅26.8 M^-1 s^-1
- VIGS沉默CrUGT8显著降低长春花中长春花碱和文多灵含量。⑤ GjUGT1/14（UGT75L6）催化藏红花酸羧基葡萄糖基化生成crocin-5和crocin-4
- GjUGT9（UGT94E5）催化crocin-5→crocin-4及crocin-3→crocin-2→crocin-1。⑥ CaUGT3与VvGT1氨基酸序列一致性仅17.8%，同源模型显示底物口袋关键残基His125/Asn206使口袋扩大
- His125Phe突变使kcat/Km从573降至1.07 M^-1 s^-1。⑦ 大鼠口服试验中，槲皮素和芦丁生物利用度仅2%和0.8%，而异槲皮苷、3-O-麦芽糖槲皮素和EMIQ分别为12%、30%和35%
- α-单葡萄糖基芦丁和α-低聚葡萄糖基芦丁即使水溶性改善，生物利用度仍仅4.1%和1.8%
- 肠道水解实验表明配糖体需被小肠糖苷酶水解为苷元才有利于吸收。
研究结论
植物PSPG是可催化低分子亲脂性化合物区域/立体选择性糖基化的优良生物催化剂；利用AtSUS1/sucrose的UDP-葡萄糖循环可显著提高糖苷合成效率。糖链结构直接影响口服吸收，只有能被小肠α/β-葡萄糖苷酶水解为苷元的配糖体才能有效提高生物利用度。随着基因组信息积累，发掘和功能鉴定更多PSPG将促进功能性天然产物糖链的高效构建。