Optimal trade-off between boosted tolerance and growth fitness during adaptive evolution of yeast to ethanol shocks
- 作者
- Ana Paula Jacobus, Stella Diogo Cavassana, Isabelle Inácio de Oliveira, Joneclei Alves Barreto, Ewerton Rohwedder, Jeverson Frazzon, Thalita Peixoto Basso, Luiz Carlos Basso, Jeferson Gross
- 单位
- Bioenergy Research Institute, São Paulo State University, Rio Claro, Brazil; SENAI Innovation Institute for Biotechnology, São Paulo, Brazil; Biological Science Department, "Luiz de Queiroz" College of Agriculture, University of Sao Paulo, Piracicaba, Brazil; Institute of Food Science and Technology, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil; Department of Agri-Food Industry, Food and Nutrition, "Luiz de Queiroz" College of Agriculture, University of Sao Paulo, Piracicaba, Brazil
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels and Bioproducts（2024）
- DOI
- 10.1186/s13068-024-02503-7
- 所属领域
- 代谢工程 / 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在利用剧烈乙醇休克筛选耐受性酵母时，如何在提高乙醇耐受性的同时避免生长和发酵性能的适应性权衡（trade-off），并解析其遗传基础。
研究策略
对巴西生物乙醇酵母PE-2_H4进行适应性实验室进化（ALE），通过68-82轮2小时乙醇休克（19-30% v/v）与恢复生长交替筛选；对进化克隆进行全基因组测序，结合反向工程（CRISPR/Cas9和基因破坏）构建突变株，并通过竞争实验、微板生长测定和模拟巴西乙醇工业发酵评估适合度与发酵性能。
研究路线图
核心内容
该研究针对剧烈乙醇休克筛选酵母时耐受性与生长性能之间的适应性权衡问题，对巴西生物乙醇菌株PE-2_H4进行适应性实验室进化，通过68至82轮高浓度乙醇休克与恢复生长交替筛选获得进化克隆。全基因组测序结合反向工程揭示cAMP/PKA信号通路和海藻糖降解途径突变是乙醇耐受的核心适应机制，其中组合cyr1A1474T与usv1Δ双突变体的关键。该双突变体在8%乙醇中每代适合度提高5.46%，而无乙醇条件下仅损失1.07%，实现了耐受性与生长的最优平衡。此外，P4群体通过BUD3破坏形成雪花状多细胞聚集体，以集体应激保护策略应对休克。在模拟巴西蔗糖糖蜜工业发酵中，双突变体表现出更高的细胞活力或生物量积累，但乙醇滴度提升有限（循环3至5中约高1%）。该工作表明，剧烈休克筛选虽易导致生长代价，但通过关键突变组合的反向工程可有效平衡耐受性与发酵性能，为筛选适应多应激工业条件的酵母菌株提供可行策略。
创新点
揭示了cAMP/PKA和海藻糖降解途径突变是乙醇休克耐受的核心适应机制；通过反向工程组合cyr1A1474T与usv1Δ获得在8%乙醇中生长优势且无显著生长代价的菌株；发现P4群体通过BUD3破坏形成雪花状多细胞聚集表型作为集体应激保护策略。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae PE-2_H4 | cAMP/PKA信号通路 | CYR1 | Cyr1p (adenylate cyclase) | 催化 | 突变cyr1A1474T降低PKA活性，增强应激反应 |
| Saccharomyces cerevisiae PE-2_H4 | cAMP/PKA信号通路 | RAS2 | Ras2p (GTP-binding protein) | 调控 | RAS2突变下调cAMP/PKA通路，在P4中为功能缺失突变 |
| Saccharomyces cerevisiae PE-2_H4 | cAMP/PKA信号通路 | MDS3 | Mds3p | 调控 | MDS3敲除模拟低PKA表型，在P2和P3中突变 |
| Saccharomyces cerevisiae PE-2_H4 | cAMP/PKA信号通路 | PMD1 | Pmd1p | 调控 | MDS3旁系同源物，在P3中突变 |
| Saccharomyces cerevisiae PE-2_H4 | 海藻糖代谢 | ATH1 | Ath1p (acid trehalase) | 催化 | 功能缺失突变导致海藻糖积累增强乙醇耐受 |
| Saccharomyces cerevisiae PE-2_H4 | 海藻糖代谢 | NTH1 | Nth1p (neutral trehalase) | 催化 | P3c中移码突变，阻断海藻糖分解 |
| Saccharomyces cerevisiae PE-2_H4 | 应激响应调控 | USV1 | Usv1p (C2H2 zinc finger transcription factor) | 调控 | 敲除后与cyr1A1474T协同提高乙醇耐受和生长 |
| Saccharomyces cerevisiae PE-2_H4 | 细胞壁完整性信号 | ROM2 | Rom2p (GEF for Rho1/Rho2) | 调控 | P1和P3中突变，但单独未验证到适合度贡献 |
| Saccharomyces cerevisiae PE-2_H4 | 肽转运 | PTR2 | Ptr2p (di/tripeptide transporter) | 转运 | P3和P4中突变，未验证到适应度贡献 |
| Saccharomyces cerevisiae PE-2_H4 | 细胞分裂/芽位选择 | BUD3 | Bud3p | 调控 | P4中功能缺失导致雪花状多细胞聚集，提供集体保护 |
关键发现
- 进化克隆P1c-P3c在24%乙醇休克2h后选择系数显著高于亲本
- P1c在19%乙醇休克后存活率和海藻糖含量最高（海藻糖达细胞湿重23%以上）。cyr1A1474T/usv1Δ双突变体在8% (v/v)乙醇中每代适合度提高5.46%，而无乙醇条件下仅损失1.07%。在模拟巴西蔗糖糖蜜发酵（细胞回用+硫酸处理）中，P1c和cyr1A1474T/usv1Δ表现出更高的细胞活力或生物量积累，但乙醇滴度未显著提高（cyr1A1474T/usv1Δ在循环3-5中乙醇积累约高1%）。
研究结论
剧烈乙醇休克筛选可导致生长适合度下降，但通过反向工程将关键突变组合（cyr1A1474T/usv1Δ）能实现乙醇耐受与生长性能的平衡；该策略可用于筛选适应多应激工业发酵条件的酵母菌株。