Mining methods and typical structural mechanisms of terpene cyclases
- 作者
- Zheng-Yu Huang, Ru-Yi Ye, Hui-Lei Yu, Ai-Tao Li, Jian-He Xu
- 杂志
- Bioresources and Bioprocessing（2021）
- DOI
- 10.1186/s40643-021-00421-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
萜烯环化酶是萜类化合物生物合成中的关键酶，负责形成多样化的环状骨架，但酶的挖掘方法和结构机制尚需系统梳理。本文旨在总结新的基因组挖掘方法及典型萜烯环化酶的结构与催化机制，以促进新酶的发现、改造与应用。
研究策略
系统综述了萜烯环化酶的多种挖掘方法（直接克隆、基因组分析、基因簇检索、基于生物合成途径的基因筛选、转录组分析）以及I类萜烯环化酶（单萜、倍半萜、二萜环化酶）的典型结构与反应机制，结合代表性酶的结构分析和突变研究。
核心内容
萜烯环化酶是决定萜类化合物骨架多样性的关键酶，但其催化效率普遍较低且产物特异性难以预测。该综述系统梳理了萜烯环化酶的基因组挖掘方法，包括直接克隆、基因组分析、基因簇检索和转录组分析等，并深入解析了I类萜烯环化酶的典型结构与催化机制。通过对多个代表性酶的结构研究，揭示了底物结合口袋塑造、阳离子-π作用、水分子调控及活性位点闭合运动等构效关系。动力学数据表明该类酶kcat普遍偏低（如CS为0.053 s⁻¹，EAS仅0.005 s⁻¹），成为萜类高效生产的瓶颈。但结构导向的突变可显著改变产物特性：AaBOS五突变体产生68.8%的γ-蛇麻烯，EIZS F95H突变体产生50%的β-姜黄烯且kcat/KM达2600 M⁻¹ s⁻¹，S/CS N338A突变体可将底物从GPP转为FPP。此外，(+)-α-双没药醇已在酵母中实现约83 mg/L的从头合成。这些发现表明，结合基因组挖掘与结构机制理解，可实现对环化酶产物特异性和催化效率的理性改造，为新萜类产物的发现和高效生物合成提供了重要策略。
创新点
综合比较了多种酶挖掘方法的适用性与局限性；深入剖析了多个典型萜烯环化酶的构效关系，包括底物结合口袋的塑造、阳离子-π作用、水分子调控、活性位点闭合运动等，并总结了通过突变改变产物特异性的策略。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Salvia officinalis | 单萜生物合成 | — | Bornyl diphosphate synthase (SoBPPS) | 催化 | 催化GPP环化生成(+)-龙脑基二磷酸，是首个获得晶体结构的单萜环化酶（PDB:1N1B），具有αβ结构域，活性中心在α域。 |
| Citrus sinensis | 单萜生物合成 | — | (+)-Limonene synthase ((+)-LS) | 催化 | 催化GPP生成(+)-柠檬烯，晶体结构PDB:5UV0，I336残基决定底物结合方向。 |
| Mentha spicata | 单萜生物合成 | — | (-)-Limonene synthase ((-)-LS) | 催化 | 催化GPP生成(-)-柠檬烯，晶体结构PDB:2ONG/2ONH，M458残基控制产物立体选择性。通过蛋白质工程可转化为蒎烯合酶或水芹烯合酶。 |
| Salvia fruticosa | 单萜生物合成 | — | 1,8-Cineole synthase (SfCS) | 催化 | 催化GPP经α-松油基阳离子生成1,8-桉叶素，N338残基控制水分子淬灭碳正离子；N338A突变使底物从GPP转向FPP，产生49% trans-α-佛手柑油烯。 |
| Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 | 单萜生物合成 | — | 1,8-Cineole synthase (ScCS) | 催化 | 首个来源于细菌的单萜环化酶，仅含α结构域，W58和N305调控水分子。 |
| Artemisia annua | 倍半萜生物合成 | — | α-Bisabolol synthase (AaBOS) | 催化 | 催化FPP环化生成α-双没药醇，晶体结构PDB:4FJQ；五突变体(V373N/L381A/I395V/N398I/L399T)产生68.8% γ-蛇麻烯。 |
| Artemisia kurramensis | 倍半萜生物合成 | — | (+)-α-Bisabolol synthase | 催化 | 高对映选择性合成(+)-α-双没药醇，在酵母中产量约83 mg/L。 |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 倍半萜生物合成 | — | epi-Isoziazeane synthase (EIZS) | 催化 | 催化FPP环化生成epi-异紫穗槐烷，进而氧化为抗生素albaflavenone。晶体结构PDB:3KB9；F95H突变体产生50% β-姜黄烯，kcat/KM为2600 M⁻¹ s⁻¹，比α-双没药烯合酶高70倍。 |
| Penicillium roqueforti | 倍半萜生物合成 | — | Aristolochene synthase (PrAS) | 催化 | 催化FPP环化生成aristolochene，晶体结构PDB:1DI1，Y92、F112、F178等残基控制环化构象。 |
| Aspergillus terreus | 倍半萜生物合成 | — | Aristolochene synthase (AtAS) | 催化 | 催化FPP环化生成aristolochene，晶体结构PDB:2OA6，四聚体可能抑制活性，QM/MM模拟揭示环化动态过程。 |
| Nicotiana tabacum | 倍半萜生物合成 | — | 5-epi-Aristolochene synthase (EAS) | 催化 | 催化FPP环化生成5-epi-aristolochene，是首个获得晶体结构的植物萜烯环化酶（PDB:5EAT），D444-Y520双联体与产物杂泛性相关。 |
| Taxus brevifolia | 二萜生物合成 | — | Taxadiene synthase (TS) | 催化 | 催化GGPP环化生成taxadiene，即紫杉醇的骨架。晶体结构PDB:3P5P/3P5R，含αβγ三结构域；W753H突变体主产物为combine A，Y841F突变体主产物为verticillia-3,7,12(13)-triene。 |
| Streptomyces melanosporofaciens | 二萜生物合成 | — | Cyclooctat-9-en-7-ol synthase (CotB2) | 催化 | 首个来源于细菌的二萜环化酶晶体结构（PDB:4OMG），催化GGPP环化生成cyclooctat-9-en-7-ol。 |
| Escherichia coli | MVA途径 | — | — | 能量供给 | 作为异源宿主用于表达萜烯环化酶基因，例如利用IPP毒性筛选策略发现萜烯环化酶。 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | — | — | 能量供给 | 作为真核宿主用于萜类化合物的异源合成，如(+)-α-双没药醇的de novo合成产量约83 mg/L。 |
关键发现
- 多项动力学数据显示萜烯环化酶的kcat普遍较低（如CS kcat=0.053 s⁻¹，EAS kcat=0.005 s⁻¹，TS kcat=0.011 s⁻¹），限制了萜类的高效生产。结构突变可显著改变产物：AaBOS五突变体（V373N/L381A/I395V/N398I/L399T）产生68.8%的γ-蛇麻烯
- EIZS F95H突变体产生50%的β-姜黄烯，其kcat/KM达2600 M⁻¹ s⁻¹，是α-双没药烯合酶的70倍
- S/CS N338A突变体将底物从GPP转为FPP，产生49%的trans-α-佛手柑油烯
- (+)α-双没药醇可在酵母中从头合成，产量约83 mg/L。
研究结论
萜烯环化酶是萜类结构多样性的主要决定因素，基因组挖掘和结构机制研究是发现和改造该酶的有力手段。通过理解底物结合口袋、金属离子协同和阳离子中间体稳定机制，可理性设计环化酶以产生新萜类产物或提高催化效率。