Tuning a bi-enzymatic cascade reaction in Escherichia coli to facilitate NADPH regeneration for ε-caprolactone production
- 作者
- Jinghui Xiong, Hefeng Chen, Ran Liu, Hao Yu, Min Zhuo, Ting Zhou, Shuang Li
- 单位
- School of Biology and Biological Engineering, South China University of Technology, Higher Education Mega Center, Guangzhou 510006, China; School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China
- 杂志
- Bioresources and Bioprocessing（2021）
- DOI
- 10.1186/s40643-021-00370-w
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决双酶级联反应中醇脱氢酶（ADH）和环己酮单加氧酶（CHMO）表达比例失衡导致的NADPH再生与消耗不匹配问题，以提高ε-己内酯的产量和底物耐受性。
研究策略
在大肠杆菌中共表达ADH和CHMO，通过设计核糖体结合位点（RBS）序列精细调控两种酶的表达水平，优化ADH/CHMO活性比例，实现NADPH自给再生；并采用静息细胞分批补料策略进一步提高ε-己内酯产量。
核心内容
本研究在大肠杆菌BL21(DE3)中构建了由醇脱氢酶（ADH）和环己酮单加氧酶（CHMO）组成的双酶级联催化体系，用于从环己醇生产ε-己内酯。针对两酶表达比例失衡导致NADPH再生与消耗不匹配的问题，通过核糖体结合位点（RBS）工程精细调控酶表达水平：将ADH的SD序列由GGAGA突变为GCAGA以降低其表达，同时将CHMO的RBS替换为RBS_C11，使CHMO/ADH活性比从0.34提升至0.66。最优菌株BDR-11在60 mM环己醇底物下ε-己内酯产量达0.80 mol/mol，而起始菌株BDT-1在20 mM底物下仅0.38 mol/mol。采用低细胞密度（10 g/L湿重）结合四批次补料策略，最终获得126.0 mM ε-己内酯，总摩尔产率0.788 mol/mol。结果表明，RBS工程有效平衡了双酶表达，实现了NADPH自给供给，显著提高了底物耐受性和生产效率，为ε-己内酯的工业生物合成提供了可行方案。
创新点
通过RBS工程将ADH的SD序列从GGAGA突变为GCAGA降低其表达；将CHMO的RBS替换为RBS_C11（T7 RNAP翻译速率162491.50 au），使CHMO/ADH活性比从0.34提升至0.66，显著提高底物耐受性和产物转化率；利用低细胞密度（10 g/L湿重）实现高浓度底物转化。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 双酶级联（环己醇→环己酮→ε-己内酯） | adh | 醇脱氢酶（ADH） | 催化 | 来自Lactobacillus kefir，催化环己醇氧化为环己酮并产生NADPH |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 双酶级联（环己醇→环己酮→ε-己内酯） | chmo | 环己酮单加氧酶（CHMO） | 催化 | 来自Acinetobacter calcoaceticus的突变体（C376L/M400I/T415C/A463C），催化环己酮氧化为ε-己内酯并消耗NADPH |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 双酶级联（环己醇→环己酮→ε-己内酯） | RBS系列（RBS_A0突变、RBS_C0、RBS_C5、RBS_C7、RBS_C10、RBS_C11等） | — | 调控 | 通过核糖体结合位点序列设计调控ADH和CHMO的翻译水平，优化酶活性比例 |
关键发现
- 最优突变株BDR-11在60 mM环己醇底物下ε-己内酯产量达0.80 mol/mol，而起始菌株BDT-1在20 mM底物下仅0.38 mol/mol
- 通过四批次补料（每批40 mM环己醇）最终获得126.0 mM ε-己内酯，总摩尔产率0.788 mol/mol。RBS调控后，CHMO活性提高25%~60%，在40 mM底物时ε-己内酯产率达95.5%±0.4%。BDR-2在80 mM底物下产率仅约22%，优化菌株（BDR-5/7/10/11）在16 h和24 h后产率分别达43.1%~59.2%和50.2%~69.5%。ADH活性在BDT-1中为1.66 U/mL，SD突变后BDT-2降至0.66 U/mL，CHMO活性从0.10 U/mL升至0.19 U/mL
- pRSFDuet-1载体上BDR-1中ADH和CHMO活性分别为2.9 U/mL和0.2 U/mL。
研究结论
RBS工程有效平衡了ADH与CHMO的表达比例，实现了NADPH的自我供给，显著提高了ε-己内酯全细胞催化的底物耐受性和生产效率，菌株BDR-11及分批补料策略为工业应用提供了可行方案。