Computational-guided discovery of UDP-glycosyltransferases for lauryl glucoside production using engineered E. coli
- 作者
- Kasimaporn Promubon, Kritsada Tathiya, Aussara Panya, Wasu Pathom-Aree, Pachara Sattayawat
- 单位
- Department of Biology, Faculty of Science, Chiang Mai University, Chiang Mai 50200, Thailand; Cell Engineering for Cancer Therapy Research Group, Faculty of Science, Chiang Mai University, Chiang Mai 50200, Thailand; Master of Science Program in Applied Microbiology (International Program), Faculty of Science, Chiang Mai University, Chiang Mai 50200, Thailand
- 杂志
- Bioresources and Bioprocessing（2024）
- DOI
- 10.1186/s40643-024-00820-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏能催化1-十二醇糖基化生成月桂基葡糖苷的UDP-糖基转移酶，且该化合物没有天然合成途径，需要开发新的生物合成路线。
研究策略
开发计算引导的酶筛选工作流：以拟南芥UDP-糖基转移酶为模板，对Candida、Pichia、Rhizopus和Thermotoga基因组进行BLASTp搜索，经功能预测、信号肽过滤、保守区域分析、AlphaFold2结构预测和分子对接，选出候选酶RO3G并在E. coli BL21(DE3)中异源表达，通过饲喂1-十二醇验证其催化活性。
核心内容
本研究针对缺乏能催化1-十二醇糖基化生成月桂基葡糖苷的UDP-糖基转移酶这一问题，开发了一套计算引导的酶筛选工作流。以拟南芥UGT72B1为模板，对多种真菌及细菌基因组进行BLASTp搜索，经功能预测、信号肽过滤、保守区域分析、AlphaFold2结构预测和分子对接，最终从240个预测糖基转移酶中筛选出源自Rhizopus delemar的候选酶RO3G，并在E. coli BL21(DE3)中异源表达。饲喂2.0 mM 1-十二醇后，上清液中月桂基葡糖苷产量为0.026 mM，细胞沉淀中为0.016 mM，LC-MS确认产物存在。值得注意的是，表达RO3G改变了发酵产物分布，使乙酸盐产量从2.05 g/L降至1.58 g/L，乙醇也显著降低，而细胞生长和葡萄糖消耗不受影响。该工作首次报道了具有1-十二醇活性的UDP-糖基转移酶，建立了从基因组挖掘到分子对接再到体内验证的完整流程，为利用微生物合成糖苷类表面活性剂提供了新酶资源，但该酶对底物的特异性仍有提升空间，后续可通过蛋白质工程优化。
创新点
首次报道了具有1-十二醇活性的UDP-糖基转移酶（RO3G）；建立了从基因组挖掘到分子对接再到体内验证的计算工作流；发现表达RO3G可改变E. coli发酵产物分布，降低乙酸盐和乙醇产量。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 月桂基葡糖苷生物合成 | RO3G_17395 (EIE92684.1) | UDP-糖基转移酶RO3G | 催化 | 异源表达，催化1-十二醇糖基化生成月桂基葡糖苷 |
| Rhizopus delemar RA 99-880 | 月桂基葡糖苷生物合成 | RO3G_17395 | RO3G | 催化 | RO3G基因的原始来源宿主 |
| Arabidopsis thaliana | UDP-糖基转移酶模板 | UGT72B1 | UGT72B1 | 催化 | 用于分子对接结合口袋参考的模板酶 |
关键发现
- 从240个预测糖基转移酶中筛选出8个候选，分子对接选择RO3G（EIE92684.1，来自Rhizopus delemar RA 99-880）。在E. coli BL21(DE3)中表达RO3G，饲喂2.0 mM 1-十二醇后，上清液中月桂基葡糖苷产量为0.026±0.001 mM，细胞沉淀中为0.016±0.001 mM
- LC-MS确认产物m/z [M-H]-=348.5。48h后1-十二醇剩余0.58±0.02至0.70±0.03 mM。与GFP对照菌株相比，RO3G菌株乙酸盐产量显著降低（1.58±0.08 g/L vs 2.05±0.07 g/L），乙醇也显著降低，而甲酸盐和乳酸盐无显著差异
- 细胞生长和葡萄糖消耗无显著差异。对照菌株中也检测到极少量月桂基葡糖苷，提示E. coli内源糖基转移酶有微弱活性。
研究结论
本研究成功开发了一种计算工作流，发现了一种能催化1-十二醇糖基化的新型UDP-糖基转移酶RO3G，并在E. coli中实现了月桂基葡糖苷的合成。该酶对1-十二醇的特异性仍有提升空间，未来可通过蛋白质工程优化以提高产量。