Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice
- 作者
- Palle Serup, Carsten Gustavsen, Tino Klein, Leah A. Potter, Robert Lin, Nandita Mullapudi, Ewa Wandzioch, Angela Hines, Ashley Davis, Christine Bruun, Nina Engberg, Dorthe R. Petersen, Janny M. L. Peterslund, Raymond J. MacDonald, Anne Grapin-Botton, Mark A. Magnuson, Kenneth S. Zaret
- 杂志
- Disease Models & Mechanisms（2013）
- DOI
- 10.1242/dmm.009696
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
现有转基因信号报告系统受随机整合位置效应影响，难以在统一基因组背景下系统性比较不同信号通路，且缺乏可活体监测的等位基因系列。
研究策略
利用重组酶介导的盒式交换(RMCE)将多聚化信号响应元件（RARE、IBRE、ARE、SuTOP、CSL）分别替换小鼠Rosa26启动子的四个不同缺失区域，构建等位基因系列的信号哨兵ES细胞系和转基因小鼠。
核心内容
该研究利用重组酶介导的盒式交换技术，将视黄酸（RARE）、BMP（IBRE）、Activin（ARE）、Wnt（SuTOP）和Notch（CSL）五类信号响应元件分别插入小鼠Rosa26位点启动子的四个不同缺失区域，构建了可在同一基因组背景下比较多种信号通路的等位基因系列“信号哨兵”ES细胞系及转基因小鼠。结果显示，DR5-TA-CFP在Rosa26-60位点对视黄酸的响应从10⁻¹⁰ M起始、10⁻⁸ M饱和，而-228位点灵敏度低约100倍；BMP哨兵响应1–30 ng/ml BMP4且约100%细胞被激活，Activin哨兵响应12–100 ng/ml activin A但呈异质性；Wnt哨兵在含CHIR99021的2i条件下于-60位点强烈激活，Notch哨兵在NICD转染后约25%细胞表达报告基因。该系统实现了低背景、高灵敏度的多通路正交监测，适用于活细胞与活体胚胎，且原理可推广至其他通路及人类ES细胞，为信号通路体内动态研究提供了标准化工具。
创新点
在单一Rosa26基因组位点建立多种信号通路的正交报告系统；通过启动子部分缺失实现低背景和高灵敏度的信号监测；支持多种荧光蛋白（CFP、mCherry、mOrange）同时监测；适用于活细胞和活体胚胎。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 小鼠ES细胞 | 视黄酸信号 | Rara/Rxra | RAR/RXR | 调控 | DR5-TA-CFP响应元件插入Rosa26 -60和-228位点，对RA高度敏感且特异。 |
| 小鼠ES细胞 | BMP信号 | Smad1/Smad5 | SMAD1/5/8 | 调控 | IBRE4-TA-CFP含有Smad7基因的BMP响应元件，响应BMP4。 |
| 小鼠ES细胞 | Activin/Nodal信号 | Foxh1 | FoxH1/Fast-1 | 调控 | AR8-TA-mCherry含有非洲爪蟾Mix.2基因的activin响应元件，响应activin A。 |
| 小鼠ES细胞 | Wnt信号 | Ctnnb1 | β-catenin/TCF/LEF | 调控 | SuTOP-TA-CFP含有8xTCF/LEF结合位点，响应Wnt/β-catenin信号。 |
| 小鼠ES细胞 | Notch信号 | Rbpj | CSL/RBPJ | 调控 | 12xCSL-TA-mOrange含有CSL转录因子结合位点，响应Notch信号。 |
| 小鼠ES细胞 | RMCE基因打靶 | Cre | Cre重组酶 | 催化 | 用于介导lox位点间的盒式交换，实现信号哨兵构建体的定向整合。 |
关键发现
- DR5-TA-CFP在Rosa26 -60位点对RA的响应从10^-10 M开始，10^-8 M饱和
- 228位点灵敏度低约100倍，10^-7 M饱和
- RA拮抗剂AGN193109抑制信号。BMP哨兵（IBRE4-TA-CFP）响应1-30 ng/ml BMP4，activin A哨兵（AR8-TA-mCherry）响应12-100 ng/ml activin A，均需48小时达到最大诱导
- BMP哨兵约100%细胞响应，activin A哨兵呈现异质性。Wnt哨兵（SuTOP-TA-CFP）在LIF+2i（含3 μM CHIR99021）下于-60位点被强烈激活，-228较弱
- Wnt3a可微弱激活-60构建体，Dkk1抑制此响应。Notch哨兵（12xCSL-TA-mOrange）在NICD转染后约25%细胞表达mOrange，NEXT较弱，γ-secretase抑制剂阻断信号。
研究结论
该信号哨兵系统能够在统一基因组背景下高效、特异性地监测RA、BMP、Activin A、Wnt和Notch信号，适用于活细胞和活体胚胎，且原理上可推广至其他信号通路以及人类ES细胞。