From flavors and pharmaceuticals to advanced biofuels: Production of isoprenoids in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Stefan Tippmann, Yun Chen, Verena Siewers, Jens Nielsen
- 单位
- Systems & Synthetic Biology, Department of Chemical and Biological Engineering, Chalmers University of Technology, Gothenburg, Sweden; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark, Hørsholm, Denmark
- 杂志
- Biotechnology Journal（2013）
- DOI
- 10.1002/biot.201300028
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过代谢工程改造酿酒酵母，实现异戊二烯类化合物（从香料、药物到先进生物燃料）的高效生产，以克服植物提取和化学合成的局限性。
研究策略
综述了多种代谢工程策略：增强甲羟戊酸（MVA）途径通量、限制FPP池的竞争消耗（如下调鲨烯合酶）、亚细胞区室化（线粒体靶向）、合酶工程改造，以及双相发酵缓解毒性等。
核心内容
该综述系统评估了以酿酒酵母为底盘生产异戊二烯类化合物的代谢工程策略，所涉产物覆盖香料、药物前体直至先进生物燃料。核心改造思路包括强化甲羟戊酸途径通量、下调ERG9以限制FPP向甾醇方向的竞争消耗、将合酶靶向线粒体实现区室化表达、改造合酶自身活性，以及采用双相发酵缓解产物毒性。相比大肠杆菌，酿酒酵母在表达细胞色素P450氧化酶完成紫杉醇、青蒿酸等复杂骨架的后修饰方面具有独特优势。代表性结果包括：过表达MVA途径并引入amorphadiene合酶，补料分批发酵产物达40 g/L；引入完整氧化途径后青蒿酸产量达25 g/L。下调ERG9使valencene产量提高50%，线粒体靶向合酶使其产量提高约3倍，联合FPP合酶靶向再增加40%。法尼烷十六烷值58.6，优于传统柴油。这些进展表明酵母细胞工厂已成为异戊二烯类化合物生产的关键平台，但通路复杂性、产物毒性和合酶低活性仍是限制瓶颈，系统生物学工具将加速细胞工厂迭代设计。
创新点
系统比较了酿酒酵母与大肠杆菌生产异戊二烯的优势，重点阐述了酵母在表达细胞色素P450酶方面的独特优势，并总结了从香料/药物到生物燃料的跨领域应用策略。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | HMG1 | Hmg1p | 催化 | HMG-CoA还原酶，催化HMG-CoA转化为甲羟戊酸，是MVA途径限速酶；截短型tHmg1常被过表达以增强通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ERG20 | Erg20p（FPP合酶） | 催化 | 兼具GPP合酶和FPP合酶活性，催化IPP与DMAPP缩合生成GPP，再加成IPP生成FPP，处于异戊二烯分支点 |
| Saccharomyces cerevisiae | 异戊二烯下游/甾醇合成 | ERG9 | Erg9p（鲨烯合酶） | 催化 | 催化两分子FPP缩合为鲨烯，竞争FPP池；下调其表达可提高异戊二烯产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜合成 | BTS1 | Bts1p（GGPP合酶） | 催化 | 催化FPP与IPP缩合生成GGPP，为二萜（如紫杉二烯）提供前体 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | IDI1 | Idi1p（IPP:DMAPP异构酶） | 催化 | 催化IPP异构化为DMAPP，调节前体比例 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素生物合成 | CYP71AV1 | Cyp71av1p（细胞色素P450氧化酶） | 催化 | 氧化amorphadiene生成artemisinic alcohol/aldehyde/acid，是青蒿酸合成的关键P450酶 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素生物合成 | CPR1 | Cpr1p（P450还原酶） | 催化 | 为CYP71AV1提供电子，是P450氧化系统的必需伴侣 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素生物合成 | ADH1/ALDH1 | Adh1p/Aldh1p（醇/醛脱氢酶） | 催化 | 将artemisinic alcohol和aldehyde氧化为artemisinic acid，显著提高青蒿酸产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径调控 | UPC2 | Upc2p | 调控 | 甾醇合成转录因子，点突变（如upc2-1）可上调MVA途径基因表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 药物外排/耐受 | PDR网络（PDR5等） | Pdr转运蛋白 | 转运 | ABC转运蛋白家族，参与疏水性毒物外排；过表达未能提高柠檬烯耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 亚细胞区室化 | 线粒体靶向序列（如CVS和FPP合酶） | 线粒体靶向的valencene合酶/FPP合酶 | 区室化 | 将合成酶靶向线粒体，提高局部前体浓度，valencene产量提高3倍，联合FPP合酶再提高40% |
| Escherichia coli | MEP途径/MVA途径 | dxs, idi | Dxs, Idi | 催化 | Dxs是MEP途径限速酶，Idi是IPP:DMAPP异构酶；过表达结合异源MVA途径和FPP合酶-α-法尼烯合酶融合体，α-法尼烯产量达380 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径上游 | ERG10, ERG13, ERG12, ERG8, ERG19 | 乙酰乙酰CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | MVA途径系列酶，从乙酰-CoA到IPP的合成步骤 |
关键发现
- 植物提取效率低（青蒿素仅占黄花蒿干重0.44%）
- 化学合成紫杉醇需37步、产率仅0.4%
- 酿酒酵母中过表达MVA途径及amorphadiene合酶，补料分批发酵amorphadiene产量达40 g/L，引入完整氧化途径后artemisinic acid产量达25 g/L
- 大肠杆菌amorphadiene产量25 g/L
- 酿酒酵母taxadiene产量8.7 mg/L，而大肠杆菌达1 g/L
- 下调ERG9使valencene产量提高50%，线粒体靶向valencene合酶使其产量提高3倍，联合FPP合酶靶向再提高40%
- 酿酒杆菌中farnesol最高4.63 g/L，大肠杆菌中135.5 mg/L（48 h）
- 双相发酵将柠檬烯最低抑菌浓度提高到42.1 g/L
- α-farnesene在大肠杆菌中达380-400 mg/L，β-farnesene在酿酒酵母中762 mg/L、大肠杆菌中1100 mg/L
- bisabolene在两种宿主中均>900 mg/L
- 氢化法尼烷十六烷值58.6，优于传统柴油。
研究结论
微生物细胞工厂已成为异戊二烯类化合物生产的关键平台技术，酿酒酵母尤其适用于需要P450修饰的复杂化合物；但仍需解决通路复杂性、产物毒性及合酶活性低等问题，系统生物学工具将加速未来细胞工厂的设计。